超聲波萃取-高效液相色譜-串聯質譜同時測沉積物中10種PPCPs化合物

張盼偉，趙高峰，周懷東，余麗琴，李　昆，文　武，李科林

1.中南林業科技大學環境科學與工程研究中心，湖南 長沙 410004

2.中國水利水電科學研究院，北京 100038

近年來，藥物及個人護理產品(PPCPs)作為一類“新興”的污染物已經受到人們的普遍關注。隨著現代醫學技術的發展，藥物的銷售量和使用量呈逐年上升趨勢。在我國，藥物(特別是抗生素類藥物)濫用情況嚴重，有可能造成嚴重的環境污染。目前國內關于此類污染物的分析檢測方法還不成熟，有關PPCPs污染的報道較少。國內外已經有學者開始對這一“新興”的污染物進行研究[1-3]，主要針對地表水[4-5]、地下水[6]、飲用水[7]、農業土壤[8-9]以及河流沉積物[10]中的PPCPs。在國內外使用高效液相色譜分離技術檢測抗生素類化合物已有報道[11-15]，但是在國內使用靈敏度高，定性、定量能力強的液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)技術同時檢測沉積物中多種抗生素類化合物的報道較少。該研究采用HPLC-MS/MS，在EPA 1694方法[16]的基礎上進行了改進，以期降低目標化合物的檢測限，并且在保證目標化合物回收率效果的情況下盡可能地減少樣品預處理時間，降低預處理成本。

1　實驗部分

1.1試劑與材料

10種PPCPs分別是對乙酰氨基酚(acetaminophen, 純度 99.5％)、林可霉素(lincomycin, 純度 99.0％)、甲氧芐啶(trimethoprim, 純度 99.5％)、咖啡因(caffeine, 純度 98.5％)、阿奇霉素(azithromycin, 純度 97.0％)、磺胺甲唑(sulfamethoxazole, 純度 99.5％)、泰樂菌素(tylosin, 純度 98.0％)、地爾硫卓(diltiazem, 純度 99.0％)、卡馬西平(carbamazepine, 純度 99.5％)、氟西汀(fluoxetine,純度 99.0％)標準品，氘代阿特拉津(atrazine d5, 純度≥99.5％)為回收率指示物，均購自德國。上述標準品用乙腈或甲醇配制成質量濃度為1 500 mg/kg的標準溶液，用甲醇配制成儲備液備用。所有標準溶液儲存于-18 ℃。甲醇、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷均為農殘級(J.T.Baker, Phillipsburg, USA)，甲酸(色譜純，DIKMA)，實驗用水均為超純水(經MilliQ系統純化，電阻率為18. 3 MΩ·cm)。

1.2儀器與設備

Agilent 1290型高效液相色譜儀，配有Agilent 6460質譜檢測器(ESI源)；KQ-700DE型超聲波清洗機，中國。CF16RXⅡ型離心機，日本；CHRIST冷凍干燥機,德國；Hei-VAP型，旋轉濃縮儀，德國；N-EVAP-12型氮吹儀，美國。

1.3液相色譜和質譜條件

1.3.1色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18反相柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相為0.1％(體積分數，下同)甲酸/水溶液(A)，乙腈(B)，流速為0.2 mL/min；梯度洗脫程序：8％ B保持6 min，流速為0.2 mL/min，在10 min內由8％ B增至30％ B，流速從0.3 mL/min增至0.35 mL/min，隨后在14 min內由30％ B增至100％ B；進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

1.3.2質譜條件

電離源為電噴霧電離源(ESI)，霧化器壓力為310 kPa(45 psi)，毛細管電壓為4 000 V，干燥氣溫度為300 ℃，流速為9 L/min，檢測方式為多反應監測(MRM)正離子模式。

1.4樣品前處理方法

超聲萃取：取4.0 g樣品至50 mL的潔凈三角錐瓶中，加入20 mL甲醇，30 ℃水浴中超聲萃取(功率80％×200 W) 15 min。

離心凈化：將上述上清液移入50 mL離心管中，以3 000 r/min的速度離心5 min，將上清液移至100 mL圓底燒瓶中。重復上述萃取步驟3次。將收集到的萃取液在氣壓350 hPa、水溫50 ℃的條件下旋轉濃縮至2～3 mL,待SPE凈化。

SPE凈化：SAX(500 mg, 3 mL)凈化柱依次使用乙酸乙酯及二氯甲烷各5 mL清洗，10 mL甲醇浸泡30 s進行活化，萃取液通過凈化柱后使用5 mL甲醇淋洗凈化柱。

樣品定容：將收集到的洗脫液在50 ℃水浴中使用緩和氮氣吹干，使用0.1％(體積分數，下同)甲酸/甲醇溶液定容至500 μL，待HPLC-MS/MS檢測。

2　結果與討論

2.1色譜、質譜條件的選擇和優化

根據EPA 1694方法，選取0.1％甲酸/水溶液(A)和乙腈(B)作為流動相。根據梯度洗脫[17-18]，經過反復實驗，最終確定了第1.3節所述梯度洗脫程序。在優化的梯度洗脫程序下，10種PPCPs以及氘代阿特拉津可進行較好分離(見圖1)。

1.對乙酰氨基酚； 2.林可霉素；3.甲氧芐啶；4.咖啡因；5.阿奇霉素；6.磺胺甲唑；7.地爾硫卓；8.泰樂菌素；9.卡馬西平；10.氟西汀；11.氘代阿特拉津

將10種PPCPs及氘代阿特拉津母液用甲醇配成工作液混標，首先進行全掃描(MS2-Scan模式)，找出準確的[M+H]+分子離子峰，然后對其進行子離子掃描以獲得二次碎裂產生的子離子。將分子離子和2個響應適中的子離子組成檢測離子對，以MRM模式進行檢測，在此基礎上重點優化對靈敏度影響較大的碎裂電壓和碰撞能量，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳。優化后參數見表1。

圖2　3種萃取溶劑的回收率結果比較

表110種PPCPs化合物及回收率指示物的質譜條件

化合物m/z母離子子離子裂電壓/V碰撞能量/eV對乙酰氨基酚152110　065．090901535林可霉素407　1359　1126．01101101525甲氧芐啶291261　0230．01101102525咖啡因195138　0110．01101101525阿奇霉素749　3375．2591　2158．01301303035磺胺甲唑254156　092．01101101525泰樂菌素916　3772　2174．01101103535地爾硫卓415178　0150．11301302525卡馬西平237194　0179．01101101535氟西汀310148　11105氘代阿特拉津221179　0137．0101．0110110110151515

2.2固相萃取條件的選擇和優化

2.2.1萃取溶劑的選擇

選取EPA 1694方法及其他研究中提到的甲醇[19]、乙腈[16]和二氯甲烷[20-21]作為萃取溶劑進行回收率實驗。實驗根據萃取溶劑的不同分為3組，每組5個樣品和1個實驗空白。根據第1.4節所述步驟進行樣品的前處理，并對其進行檢測，3種萃取溶劑的回收率如圖2所示。

從圖2可以看出，甲醇對10種PPCPs及氘代阿特拉津的回收率都比較好，回收率范圍為58.9％～154.0％，而乙腈和二氯甲烷對林可霉素和阿奇霉素的回收率幾乎為零，二氯甲烷對甲氧芐啶、地爾硫卓等化合物的回收率也幾乎為零，造成這種現象的原因可能是林可霉素與阿奇霉素較難溶于乙腈或二氯甲烷，甲氧芐啶與地爾硫卓較難溶于二氯甲烷，而甲醇對10種PPCPs及氘代阿特拉津都有很好的溶解作用。 因此，實驗選取甲醇作為萃取溶劑。

2.2.2去色素填充柱的選擇

實驗選用填料為SAX的陰離子交換柱(500 mg，3 mL)及填料為PC/NH2(500 mg，6 mL)的凈化柱，用乙酸乙酯和二氯甲烷各5 mL依次對凈化柱進行清洗，然后用10 mL甲醇對柱子進行活化，將萃取液移入填充柱，并用5 mL的甲醇進行洗脫，回收率結果如圖3所示。

圖3　SAX凈化柱與PC/NH2凈化柱回收率結果

從圖3可見， PC/NH2柱具有去除色素的作用，但是從回收率結果來看，PC/NH2柱除卡馬西平及氘代阿特拉津的回收率較好外，對其他化合物的回收率較差。造成這種結果的原因可能是PC/NH2柱的填料對10種PPCPs化合物的吸附作用較強，化合物不容易被洗脫。而SAX陰離子交換柱效果較好，能有效去除樣品中的色素，且10種PPCPs及氘代阿特拉津的回收率為77.6％～134.4％，方法簡便，適合大批量樣品的處理。因此，實驗選取填料為SAX的陰離子交換柱。

2.2.3洗脫溶劑的用量選擇

根據EPA 1694方法，選取甲醇作為SPE柱洗脫溶劑。每個樣品分別收集前 5 mL與后5 mL洗脫液，最終定容至1 mL進行檢測。從表2可以看出，前5 mL收集樣品的回收率為69.33％～149.72％，后收集的5 mL樣品中沒有檢測出目標化合物，說明5 mL的甲醇可以將目標化合物洗脫下來，且回收率較好。因此，實驗選用溶劑用量為5 mL。回收率結果見表2。

表 2　10種PPCPs化合物前5 mL與后5 mL洗脫液回收率結果(n=4)

2.3精密度及回收率實驗

準確稱取4.0 g石英砂作為樣品基質，根據相關文獻[22-24]報道中沉積物PPCPs的含量，選取2個加標濃度級別，分別為20、400 ng/g。根據第1.4節中的步驟對樣品進行處理，每個濃度水平5個重復，用來考察方法的總體回收率和重現性；每個濃度水平添加2個空白樣品用來檢驗實驗過程是否會帶來干擾。回收率指示物氘代阿特拉津在分析前加至石英砂中，對整個實驗過程進行質量控制。10種PPCPs及氘代阿特拉津的回收率及RSD如表3所示。添加量為20 ng/g，回收率為61.1％～128.5％，RSD為1.7％～17.5％(n=5)；添加量為400 ng/g，回收率為66.4％～126.7％，RSD為2.3％～18.0％(n=5)。該方法具有較好的重現性，精密度和回收率也符合要求。

2.4線性關系與檢測限

配制0.1、1、10、50、100、200、500 ng/g 的標準溶液，根據子離子定量，10種PPCPs及氘代阿特拉津的線性相關系數r>0.99，方法的最低檢測限以3倍信噪比進行統計，最低檢測限為0.12～4.46 ng/g。線性關系及最低檢測限見表3。

2.5實際沉積物樣品中目標化合物分析

利用該文建立的方法對海河流域徒駭河和獨流減河表層沉積物進行檢測，結果見表4。可見，該方法可以去除土壤中的色素，并且添加的回收率指示物有較好的回收效果。在獨流減河中有咖啡因(243.73 ng/g)的檢出；而在徒駭河中有對乙酰氨基酚(0.42 ng/g)、林可霉素(55.78 ng/g)、咖啡因(1.56 ng/g)和阿奇霉素(10.75 ng/g)檢出，以林可霉素為優勢污染物。

表3　10種PPCPs化合物及回收率指示物的檢測限、標準曲線、回收率(n=5)及相對標準偏差

表4　10種PPCPs化合物徒駭河與獨流減河表層沉積物中的干質量統計結果(幾何均值)　 ng/g

3　結論

基于EPA 1694方法，對樣品萃取與凈化過程進行改進，采用超聲波萃取與HPLC-MS/MS聯用技術，建立了10種PPCPs同時分析的高靈敏度檢測方法。該方法具有檢測限低和回收率高的特點，并成功應用于海河流域表層沉積物的10種PPCPs污染物的檢測。結果顯示，咖啡因在獨流減河中檢測到的質量濃度為243.73 ng/g(干質量)；對乙酰氨基酚、林可霉素、咖啡因和阿奇霉素在徒駭河中檢測到的濃度分別為0.42、55.78、1.56、10.75 ng/g(均為干質量)。這些PPCPs的來源和污染現狀有待進一步深入研究。

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