轉AtNDPK2基因甘薯的耐鹽性鑒定

王慶美等

摘要：以轉AtNDPK2基因甘薯植株為試材，根據其生理指標及表型變化來鑒定轉基因甘薯的耐鹽性。室內鑒定結果表明：在100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6的根長顯著高于對照。田間鑒定結果表明：在50 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6生長正常，而對照10 d后出現黃葉及枯萎等癥狀；在100 mmol/L NaCl脅迫下，對照植株和JN2～JN6在處理4 d后出現枯萎，而JN1生長正常。

關鍵詞：甘薯；轉基因；AtNDPK2；根長；耐鹽性

中圖分類號：S531.034文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的糧食作物及新型能源作物，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植總面積的69%，產量占世界總產量的85%。在甘薯生產中，各種環境脅迫和病蟲害對其產量和品質危害很大。世界范圍內，適宜耕作的土地已經不足10%，很多作物包括甘薯都種植在干旱、鹽漬、低溫等逆境環境中，隨著耕地的不斷減少和能源壓力的不斷增大，培育出能夠在逆境生長且品質優良的甘薯品種成為甘薯育種工作者的重要任務。

雖然常規甘薯育種技術在品種改良中發揮了重要作用，但由于種質基礎日益狹窄，甘薯種內、種間雜交不親和性等因素[1]，使常規育種受到限制。利用植物基因工程技術能夠克服常規育種中存在的物種隔離和基因連鎖等妨礙，對甘薯品種選育和生產具有潛在的推動意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為濟薯21試管苗，由山東省農業科學院作物研究所提供。轉基因植株為轉AtNDPK2基因的濟薯21再生苗。將再生的轉基因小植株切下，MS固體培養基上培養，培養條件為（27±1）℃、光照13 h/d。每2個月繼代1次。

1.2再生苗的分子鑒定

甘薯總 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 為被檢測擬轉基因植株總DNA、非轉基因植株總 DNA（陰性對照）和pCAMB2300-AtNDPK2質粒（陽性對照）。AtNDPK2基因的引物序列為：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，預計擴增片段長度 1 205 bp。NPTII基因引物為5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，預計擴增片段長度 750 bp左右。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外成像儀中觀察并拍照。

1.3轉基因植株的室內鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，切取莖尖頂端2～3 cm，分別轉接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培養基上，28℃、16 h/d光照條件下培養20 d，測定根長。每個處理5株，重復3次。

1.4轉基因植株的田間鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，轉移到育苗基質中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照條件下培養6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液進行澆灌，每個處理5盆，重復3次。每隔24 h觀察植株表型變化。

2結果與分析

2.1轉基因植株的PCR檢測

PCR檢測結果（圖1）表明，有11個擬轉基因植株及陽性對照擴增出1 205 bp的條帶，初步證明這些植株為轉基因植株，陽性率達到84.6%。NPTII基因的擴增結果與AtNDPK2結果類似。

2.2轉基因植株的室內鑒定

根長結果（圖2）顯示，正常條件下（NaCl濃度為零），轉基因植株與對照的根均能夠很好的生長。隨著NaCl濃度的提高，根的生長受到抑制，但轉基因植株的根長始終大于非轉基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 脅迫下，轉基因植株的根長顯著高于對照。

3結論與討論

鹽脅迫條件下，植物細胞內自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產生，大多數植物體內的游離脯氨酸含量都異常升高。臧寧等（2008）[3]將從擬南芥中克隆的SOS基因導入甘薯栽培品種徐薯 18和栗子香中，獲得了具有一定耐鹽性的轉基因植株。袁莉（2009）[4]通過農桿菌介導法將LOS5基因轉入甘薯品種栗子香中，提高了轉基因植株對田間鹽脅迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]構建了在葉綠體中特異誘導表達的包含CuZnSOD和APX 兩個基因的載體，采用基因槍法將目的基因導入甘薯中，提高了甘薯對氧化和冷脅迫的抗性；在甲基紫精的氧化脅迫誘導下，轉基因甘薯葉綠體中的CuZnSOD和APX表達水平均高于對照約15倍；轉基因植株在冷脅迫誘導下光合活性的降低顯著低于對照，并且轉基因植株能在脅迫后恢復光合活性。這些結果說明表達CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]將Cu/ZnSOD和APX基因轉入甘薯，通過增強NaCl脅迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐鹽性。

本試驗通過轉AtNDPK2基因甘薯植株的耐鹽性鑒定，證明AtNDPK2能提高甘薯的耐鹽性，為甘薯常規耐鹽型育種提供新種質，為鹽堿地的利用以及生態環境的改善提供技術儲備。

參考文獻：

[1]陸漱韻. 甘薯育種學[M]. 北京：中國農業出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧寧， 張美彥， 翟紅， 等. 根癌農桿菌介導的抗除草劑轉基因甘薯植株的獲得[J]. 農業生物技術學報， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表達LOS5基因的轉基因甘薯植株的獲得及耐鹽性鑒定[D]. 北京：中國農業大學， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 邊曉明， 李強， 等. 轉逆境誘導型啟動子SWPA2驅動Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐鹽性[J]. 分子植物育種， 2011， 9（6）：754-759.

摘要：以轉AtNDPK2基因甘薯植株為試材，根據其生理指標及表型變化來鑒定轉基因甘薯的耐鹽性。室內鑒定結果表明：在100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6的根長顯著高于對照。田間鑒定結果表明：在50 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6生長正常，而對照10 d后出現黃葉及枯萎等癥狀；在100 mmol/L NaCl脅迫下，對照植株和JN2～JN6在處理4 d后出現枯萎，而JN1生長正常。

關鍵詞：甘薯；轉基因；AtNDPK2；根長；耐鹽性

中圖分類號：S531.034文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的糧食作物及新型能源作物，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植總面積的69%，產量占世界總產量的85%。在甘薯生產中，各種環境脅迫和病蟲害對其產量和品質危害很大。世界范圍內，適宜耕作的土地已經不足10%，很多作物包括甘薯都種植在干旱、鹽漬、低溫等逆境環境中，隨著耕地的不斷減少和能源壓力的不斷增大，培育出能夠在逆境生長且品質優良的甘薯品種成為甘薯育種工作者的重要任務。

雖然常規甘薯育種技術在品種改良中發揮了重要作用，但由于種質基礎日益狹窄，甘薯種內、種間雜交不親和性等因素[1]，使常規育種受到限制。利用植物基因工程技術能夠克服常規育種中存在的物種隔離和基因連鎖等妨礙，對甘薯品種選育和生產具有潛在的推動意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為濟薯21試管苗，由山東省農業科學院作物研究所提供。轉基因植株為轉AtNDPK2基因的濟薯21再生苗。將再生的轉基因小植株切下，MS固體培養基上培養，培養條件為（27±1）℃、光照13 h/d。每2個月繼代1次。

1.2再生苗的分子鑒定

甘薯總 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 為被檢測擬轉基因植株總DNA、非轉基因植株總 DNA（陰性對照）和pCAMB2300-AtNDPK2質粒（陽性對照）。AtNDPK2基因的引物序列為：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，預計擴增片段長度 1 205 bp。NPTII基因引物為5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，預計擴增片段長度 750 bp左右。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外成像儀中觀察并拍照。

1.3轉基因植株的室內鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，切取莖尖頂端2～3 cm，分別轉接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培養基上，28℃、16 h/d光照條件下培養20 d，測定根長。每個處理5株，重復3次。

1.4轉基因植株的田間鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，轉移到育苗基質中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照條件下培養6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液進行澆灌，每個處理5盆，重復3次。每隔24 h觀察植株表型變化。

2結果與分析

2.1轉基因植株的PCR檢測

PCR檢測結果（圖1）表明，有11個擬轉基因植株及陽性對照擴增出1 205 bp的條帶，初步證明這些植株為轉基因植株，陽性率達到84.6%。NPTII基因的擴增結果與AtNDPK2結果類似。

2.2轉基因植株的室內鑒定

根長結果（圖2）顯示，正常條件下（NaCl濃度為零），轉基因植株與對照的根均能夠很好的生長。隨著NaCl濃度的提高，根的生長受到抑制，但轉基因植株的根長始終大于非轉基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 脅迫下，轉基因植株的根長顯著高于對照。

3結論與討論

鹽脅迫條件下，植物細胞內自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產生，大多數植物體內的游離脯氨酸含量都異常升高。臧寧等（2008）[3]將從擬南芥中克隆的SOS基因導入甘薯栽培品種徐薯 18和栗子香中，獲得了具有一定耐鹽性的轉基因植株。袁莉（2009）[4]通過農桿菌介導法將LOS5基因轉入甘薯品種栗子香中，提高了轉基因植株對田間鹽脅迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]構建了在葉綠體中特異誘導表達的包含CuZnSOD和APX 兩個基因的載體，采用基因槍法將目的基因導入甘薯中，提高了甘薯對氧化和冷脅迫的抗性；在甲基紫精的氧化脅迫誘導下，轉基因甘薯葉綠體中的CuZnSOD和APX表達水平均高于對照約15倍；轉基因植株在冷脅迫誘導下光合活性的降低顯著低于對照，并且轉基因植株能在脅迫后恢復光合活性。這些結果說明表達CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]將Cu/ZnSOD和APX基因轉入甘薯，通過增強NaCl脅迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐鹽性。

本試驗通過轉AtNDPK2基因甘薯植株的耐鹽性鑒定，證明AtNDPK2能提高甘薯的耐鹽性，為甘薯常規耐鹽型育種提供新種質，為鹽堿地的利用以及生態環境的改善提供技術儲備。

參考文獻：

[1]陸漱韻. 甘薯育種學[M]. 北京：中國農業出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧寧， 張美彥， 翟紅， 等. 根癌農桿菌介導的抗除草劑轉基因甘薯植株的獲得[J]. 農業生物技術學報， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表達LOS5基因的轉基因甘薯植株的獲得及耐鹽性鑒定[D]. 北京：中國農業大學， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 邊曉明， 李強， 等. 轉逆境誘導型啟動子SWPA2驅動Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐鹽性[J]. 分子植物育種， 2011， 9（6）：754-759.

摘要：以轉AtNDPK2基因甘薯植株為試材，根據其生理指標及表型變化來鑒定轉基因甘薯的耐鹽性。室內鑒定結果表明：在100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6的根長顯著高于對照。田間鑒定結果表明：在50 mmol/L NaCl脅迫下，轉基因株系JN1～JN6生長正常，而對照10 d后出現黃葉及枯萎等癥狀；在100 mmol/L NaCl脅迫下，對照植株和JN2～JN6在處理4 d后出現枯萎，而JN1生長正常。

關鍵詞：甘薯；轉基因；AtNDPK2；根長；耐鹽性

中圖分類號：S531.034文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0029-03

甘薯是重要的糧食作物及新型能源作物，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植總面積的69%，產量占世界總產量的85%。在甘薯生產中，各種環境脅迫和病蟲害對其產量和品質危害很大。世界范圍內，適宜耕作的土地已經不足10%，很多作物包括甘薯都種植在干旱、鹽漬、低溫等逆境環境中，隨著耕地的不斷減少和能源壓力的不斷增大，培育出能夠在逆境生長且品質優良的甘薯品種成為甘薯育種工作者的重要任務。

雖然常規甘薯育種技術在品種改良中發揮了重要作用，但由于種質基礎日益狹窄，甘薯種內、種間雜交不親和性等因素[1]，使常規育種受到限制。利用植物基因工程技術能夠克服常規育種中存在的物種隔離和基因連鎖等妨礙，對甘薯品種選育和生產具有潛在的推動意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為濟薯21試管苗，由山東省農業科學院作物研究所提供。轉基因植株為轉AtNDPK2基因的濟薯21再生苗。將再生的轉基因小植株切下，MS固體培養基上培養，培養條件為（27±1）℃、光照13 h/d。每2個月繼代1次。

1.2再生苗的分子鑒定

甘薯總 DNA 的提取方法按照 Saghai-Maroof 等（1984）[2]的方法。模板 DNA 為被檢測擬轉基因植株總DNA、非轉基因植株總 DNA（陰性對照）和pCAMB2300-AtNDPK2質粒（陽性對照）。AtNDPK2基因的引物序列為：5′-GTTGGCCGCATTTCGTCCTCA-3′；5′-CCACTTGCATAGCTCGCCCTC-3′，預計擴增片段長度 1 205 bp。NPTII基因引物為5′-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′，預計擴增片段長度 750 bp左右。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃（NPTII和AtNDPK2）復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外成像儀中觀察并拍照。

1.3轉基因植株的室內鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，切取莖尖頂端2～3 cm，分別轉接到含0、50、100、150 mmol/L NaCl的MS培養基上，28℃、16 h/d光照條件下培養20 d，測定根長。每個處理5株，重復3次。

1.4轉基因植株的田間鑒定

選取均勻一致的轉基因植株JN1～JN6及對照，轉移到育苗基質中，25℃、1 000 lx、16 h/d光照條件下培養6周后，用0、50、100 mmol/L的NaCl溶液進行澆灌，每個處理5盆，重復3次。每隔24 h觀察植株表型變化。

2結果與分析

2.1轉基因植株的PCR檢測

PCR檢測結果（圖1）表明，有11個擬轉基因植株及陽性對照擴增出1 205 bp的條帶，初步證明這些植株為轉基因植株，陽性率達到84.6%。NPTII基因的擴增結果與AtNDPK2結果類似。

2.2轉基因植株的室內鑒定

根長結果（圖2）顯示，正常條件下（NaCl濃度為零），轉基因植株與對照的根均能夠很好的生長。隨著NaCl濃度的提高，根的生長受到抑制，但轉基因植株的根長始終大于非轉基因植株，在 100、150 mmol/L NaCl 脅迫下，轉基因植株的根長顯著高于對照。

3結論與討論

鹽脅迫條件下，植物細胞內自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產生，大多數植物體內的游離脯氨酸含量都異常升高。臧寧等（2008）[3]將從擬南芥中克隆的SOS基因導入甘薯栽培品種徐薯 18和栗子香中，獲得了具有一定耐鹽性的轉基因植株。袁莉（2009）[4]通過農桿菌介導法將LOS5基因轉入甘薯品種栗子香中，提高了轉基因植株對田間鹽脅迫的抵抗能力。Lim 等（2007）[5]構建了在葉綠體中特異誘導表達的包含CuZnSOD和APX 兩個基因的載體，采用基因槍法將目的基因導入甘薯中，提高了甘薯對氧化和冷脅迫的抗性；在甲基紫精的氧化脅迫誘導下，轉基因甘薯葉綠體中的CuZnSOD和APX表達水平均高于對照約15倍；轉基因植株在冷脅迫誘導下光合活性的降低顯著低于對照，并且轉基因植株能在脅迫后恢復光合活性。這些結果說明表達CuZnSOD和APX基因的甘薯，其抗逆性有所提高。王欣等（2011）[6]將Cu/ZnSOD和APX基因轉入甘薯，通過增強NaCl脅迫下甘薯清除活性氧的能力，提高了甘薯的耐鹽性。

本試驗通過轉AtNDPK2基因甘薯植株的耐鹽性鑒定，證明AtNDPK2能提高甘薯的耐鹽性，為甘薯常規耐鹽型育種提供新種質，為鹽堿地的利用以及生態環境的改善提供技術儲備。

參考文獻：

[1]陸漱韻. 甘薯育種學[M]. 北京：中國農業出版社， 1998， 50-54.

[2]Saghai-Maroof M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance， chromosomal location， and population dynamics [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（24）：8014-8018.

[3]臧寧， 張美彥， 翟紅， 等. 根癌農桿菌介導的抗除草劑轉基因甘薯植株的獲得[J]. 農業生物技術學報， 2008， 16（1）：103-107.

[4]袁莉. 表達LOS5基因的轉基因甘薯植株的獲得及耐鹽性鑒定[D]. 北京：中國農業大學， 2009.

[5]Lim S， Kim Y H， Kim S H， et al. Enhanced tolerance of transgenic sweetpotato plants that express both CuZnSOD and APX in chloroplasts to methyl viologen-mediates oxidative stress and chilling[J]. Mol. Breeding， 2007， 19（3）：227-239.

[6]王欣， 邊曉明， 李強， 等. 轉逆境誘導型啟動子SWPA2驅動Cu/ZnSOD和APX基因甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]耐鹽性[J]. 分子植物育種， 2011， 9（6）：754-759.