高灌藍莓CBF基因的單核苷酸多態性分析

魏海蓉等

摘要：本研究以21個高灌藍莓品種為試材，克隆VcCBF基因，測序后分析其單核苷酸多態性（SNP），共克隆到123個非重復序列，發現120個SNP位點，單核苷酸多態性發生頻率為1/695bp，核苷酸多態性值（Pi）為0.01251。在120個SNP位點中，單態突變位點62個；簡約信息位點58個，其中雙突變55個，三突變3個。對其堿基替換方式進行分析發現，轉換91個，顛換26個，轉換與顛換的發生比率為3.5∶1。通過單倍型分析發現，21個藍莓品種的VcCBF基因存在5種單倍型。

關鍵詞：CBF；單核苷酸多態性（SNP）；藍莓

中圖分類號：Q524+.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0008-03

CBF基因（也稱為DREB1基因）編碼一個具有AP2結構域的轉錄激活子，能夠結合到CRT（C-repeat）或DRE（dehydration-responsive element）順式作用元件上，調節植物冷適應相關基因的表達[1]。CBF基因是植物冷適應及信號傳導領域最有意義的發現之一，多種與植物冷適應相關的基因都受其調控，目前已在多種重要的農作物及蔬菜中發現該基因[2～4]。Polashock等[5]從高灌藍莓（Vaccinium corymbosum）品種藍豐（Bluecrop）和兔眼藍莓（Vaccinium virgatum） 品種梯芙藍（Tifblue）中克隆到CBF基因并驗證其功能，發現CBF基因表達量和表達模式的差異可能與品種間的抗寒性不同有關。

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單核苷酸變異引起的一種序列多態性[6]。在所有可能的DNA序列差異性中，單核苷酸多態性是發生頻率最高的變異，人類90%左右的DNA序列多態性都是單核苷酸多態性[7]。單核苷酸多態性具有數量大、分布廣、穩定性強、易于分型等優點，在人類疾病的診斷及治療、致病基因的發現、族群的演化研究等方面起到了重要作用，同時在小麥、玉米、大豆等作物的物理作圖、進化研究、遺傳研究中也是有效的分子標記[6， 8～11]。

本研究以21個不同品種的高灌藍莓為材料，克隆VcCBF基因，采用直接測序法篩查其單核苷酸多態性，以期為研究VcCBF基因與藍莓抗寒性的關系奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用的21個高灌藍莓品種采自山東省果樹研究所藍莓品種資源圃，分別為伯克利（Berkeley）、喜來（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、藍豐（Bluecrop）、埃利奧特（Elliott）、達柔（Darrow）、藍塔（Bluetta）、澤西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早藍（Earliblue）、晚藍（Lateblue）、藍金（Bluegold）、瑞卡（Reka）、佐治亞寶石（Georgiagem）、密斯提（Misty）、奧尼爾（ONeal）、夏普藍（Sharpblue）、羅衛（Reveille）和普魯（Puru）。

1.2VcCBF基因的克隆、測序及單核苷酸多態性分析

以藍莓幼嫩葉片為材料，采用TIANGEN植物基因組提取試劑盒提取基因組DNA， 根據已發表的藍莓CBF基因序列設計引物進行PCR擴增。 擴增所用上游引物為5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′，下游引物為5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。PCR產物回收后采用pMD18-T載體（TaKaRa公司）連接，轉化DH5α感受態細胞，在含有Amp的LB平板上培養過夜后，挑取菌落進行菌落PCR篩選陽性克隆，每個品種選取8個，送上海生工生物工程有限公司測序[12]，所得序列采用DnaSP v5軟件分析[13]。

2結果與分析

2.1VcCBF基因的克隆

PCR所得目的片段長度為698 bp，編碼區長681 bp，將測序結果進行比對，除去重復序列，共得到123個非重復序列，每個品種有4～8個，結果見表1。

2.2VcCBF基因的單核苷酸多態性分析

將得到的123個VcCBF基因編碼區非重復序列用DnaSP v5軟件進行單核苷酸多態性分析，結果見表2。共發現了120個SNP位點，全部為單核苷酸替換，沒有InDel的情況發生，SNP的發生頻率為1/695bp，核苷酸多態性值（Pi）為0.01251。在120個SNP位點中，單態突變位點（singleton variable sites）62個，簡約信息位點（parsimony informative sites）58個，簡約信息位點中，雙突變55個，三突變3個（表3）。

3討論與結論

本研究通過對21個藍莓品種VcCBF基因的克隆測序，得到123個非重復序列，測序總長度83 394 bp，在VcCBF基因編碼區共發現120個多態性位點，單核苷酸多態性發生頻率為1/695bp，核苷酸多態性值（Pi）為0.01251。相對于其他物種，VcCBF基因的單核苷酸多態性頻率較低，這可能與其受到的選擇壓力較大相關。通過對120個SNP位點的具體分析，發現單態突變位點有62個，簡約信息位點58個（雙突變55個，三突變3個）。對堿基替換方式進行分析，發現轉換有91個，顛換為26個，轉換與顛換的比率為3.5∶1。進一步通過組裝一致序列，進行單倍型分析，發現21個藍莓品種中有5種單倍型。

直接測序法篩查SNP也存在不足，首先在克隆和測序過程中會造成假陽性，在檢測到的62個單態突變位點中可能存在克隆或測序錯誤造成的誤差。此外，高灌藍莓品種為四倍體，且多為雜交選育而來，其本身VcCBF基因的情況較為復雜，本研究從每個品種篩選8個陽性克隆進行測序，可能沒有涵蓋所有的內源VcCBF基因，從而對分析其單核苷酸多態性和單倍型造成不足。本研究對高灌藍莓CBF基因進行了初步分析，找到了部分VcCBF基因的單倍型，但每種單倍型對高灌藍莓抗寒性的貢獻還需進一步研究。

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