噬菌體展示技術篩選卵巢癌細胞表面轉移相關分子結合肽

李文桔，王樂丹，呂杰強

（溫州醫科大學附屬第二醫院 婦科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

噬菌體展示技術篩選卵巢癌細胞表面轉移相關分子結合肽

李文桔，王樂丹，呂杰強

（溫州醫科大學附屬第二醫院 婦科，浙江 溫州 325027）

目的：利用噬菌體7肽庫篩選高轉移潛能卵巢癌細胞株HO-8910PM表面轉移相關分子結合肽。方法：利用噬菌體展示技術體外快速差減篩選（biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL）卵巢癌細胞株HO-8910和HO-8910PM，經過連續5輪生物淘洗，隨機挑選14個噬菌體單克隆進行DNA測序，并進行ELISA、噬菌體競爭結合實驗驗證陽性噬菌體的親和性。結果：噬菌體克隆Z3（短肽LRLRNTR）對高轉移潛能卵巢癌細胞株HO-8910PM有較高的親和性。結論：噬菌體展示技術篩選的短肽LRLRNTR可望為卵巢腫瘤早期診斷、轉移復發及治療提供新的方向。

卵巢腫瘤；噬菌體展示技術；噬菌體多肽庫；多肽

卵巢癌的發病率僅次于宮頸癌、子宮體癌，是婦科致死率最高的惡性腫瘤[1]。因其發病隱匿，易擴散轉移，致使50%～80%停止治療的卵巢癌患者出現轉移復發，因此5年生存率始終徘徊在25%～30%[2]。雖然CA125已被廣泛用于診斷卵巢癌及監測卵巢癌治療后的復發[3-4]。但CA125的特異性不強，盡管大于80%的晚期上皮性卵巢癌患者CA125升高，但在其他生理或病理情況下CA125也會有升高[5]。因此尋找特異性更強、靈敏度更高的與腫瘤侵襲轉移相關的分子標記物用于卵巢癌的早期診斷、轉移復發及治療顯得尤為重要。

1985 年Smith[6]創立了噬菌體展示技術，經過多年的發展和完善，噬菌體展示技術在腫瘤抗原篩選、單克隆抗體、藥物研制等[7-10]方面發揮重要作用，這為研究腫瘤的發生發展、診斷及治療提供了新的方向。

本研究主要以低轉移潛能卵巢癌細胞株HO-8910為吸附細胞，高轉移潛能卵巢癌細胞株HO-8910PM為靶細胞，利用噬菌體7肽庫進行體外快速差減篩選，從而獲得卵巢癌細胞株HO-8910PM細胞表面轉移相關分子結合肽。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 隨機肽庫及主要試劑：噬菌體隨機7肽庫（Ph.D-7TM phage display peptide library）購自美國New England Biolabs公司，文庫滴度為2×1013pfu/mL，隨機多樣性為1.28×109，受體菌E.coli ER2738，-96 g I I I sequencing primer（5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’），HRP-抗M13單抗（GE Healthcare.#27-9420-01）。

1.1.2 細胞來源：卵巢癌細胞株HO-8910和HO-8910PM購自上海拜力生物科技有限公司，卵巢癌細胞株SKOV3和胰腺癌細胞株PANC-1購自上海中科院。

1.2 方法

1.2.1 差減篩選：消化、收集細胞HO-8910和HO-8910PM，重懸于含1% BSA的DMEM無血清培養液，調整細胞數為1×107/mL；取100μL HO-8910細胞，與噬菌體隨機7肽庫10μL孵育2 h（4 ℃，30 r/ min）；將細胞和噬菌體的混懸液加在200μL鄰苯二甲酸二丁酯與環己烷組成的有機分離液上（200μ L、體積比為9:1，密度為1.03 g/mL），10 000 g、4℃離心10 min；取出水相里未結合的噬菌體與100 μL HO-8910PM細胞孵育3 h后離心；取出有機相內的沉淀物，轉移至200μ L對數生長期的大腸桿菌ER2738，37 ℃孵育30 min復蘇與HO-8910PM細胞結合的噬菌體，測滴度、擴增、純化，再進入下一輪差減篩選，如此重復5個循環，測定每一輪淘洗后和擴增后的滴度，計算回收率（洗脫后的噬菌體滴度/淘洗加入噬菌體滴度）。

1.2.2 DNA測序和BLAST匹配：取第5輪生物淘洗后噬菌體鋪制的IPTG/X-gal平板，隨機挑選14個藍斑進行擴增，提取噬菌體DNA，由上海生工公司進行測序分析，通過DNA測序結果推導出多肽序列。通過網絡數據庫進行BLAST匹配分析。

1.2.3 噬菌體競爭結合實驗：分別擴增、純化經差減篩選所得到的7種噬菌體，測定擴增后的噬菌體滴度，以M13K07為對照噬菌體，測定這7種噬菌體與HO-8910PM的相對結合效率。如前所述配制HO-8910PM細胞懸液，分別將待檢測的噬菌體與M13K07噬菌體按1:1混合分別與100μ L的HO-8910PM細胞孵育2 h（4 ℃，30 r/min）；離心、復蘇、測滴度。由于M13K07噬菌體不含lac-Z基因，故在IPTG/ X-gal平板上顯示白斑，分別計數藍斑和白斑數目，按照下面的公式計算待測噬菌體與HO-8910PM細胞的相對結合效率（產出待測噬菌體數目/產出M13K07噬菌體數目）。

1.2.4 ELISA：將細胞株（HO-8910PM，SKOV3，PANC-1）以104/孔接種入96孔板；無血清培養1 h；4%多聚甲醛固定20 min；封閉液（PBS加1% W/V BSA）封閉1 h（每孔200μ L）；分別加入篩選的噬菌體克隆（1010pfu/孔），陰性對照，PBS和M13K07，37℃孵育2 h（用封閉液稀釋，預先室溫孵育15～30 min，除去非特異性結合）；加入HRP-抗M13單抗以1:6 000稀釋于封閉液中（200μL/孔）室溫孵育2 h；最后加入200μ L/孔TMB顯色液，室溫孵育20～60 min顯色，使用微板閱讀器設置在410 nm。

2 結果

2.1 差減篩選為了篩選卵巢癌細胞轉移相關分子結合肽，本實驗以HO-8910為吸附細胞，以HO-8910PM為靶細胞，利用噬菌體7肽庫進行差減篩選，計算每一輪的回收率，經過5輪差減篩選，回收率從2.0×10-5增加至4.3×10-5（見表1）。

表1 噬菌體7肽庫差減篩選HO-8910PM轉移相關分子結合肽

2.2 DNA序列測定隨機挑選14個噬菌體單克隆進行DNA序列測定，結果顯示14個噬菌體克隆包含7種氨基酸序列，其中展示Leu-Arg-Leu-Arg-Asn-Thr-Arg（LRLRNTR）序列的噬菌體被富集（見表2）。

表2 噬菌體克隆序列分析及與HO-8910PM細胞的相對結合效率（±s）

表2 噬菌體克隆序列分析及與HO-8910PM細胞的相對結合效率（±s）

出現頻率噬菌體編號Z1/7/8 Z3/4/6/11/14 Z2 Z5 Z9 Z10 Z13多肽編號ZP2 ZP1 ZP3 ZP4 ZP5 ZP6 ZP7氨基酸序列MRMTIIN LRLRNTR KIIRNTR PIKTNRK LNRMLQI IKRSKKM NPMIRRQ 3 5 2 1 1 1 1相對結合效率51.7±1.53 69.0±2.65 22.7±2.52 16.3±1.15 14.7±1.53 10.7±0.58 18.3±2.08

2.3 噬菌體競爭結合實驗以M13K07為內參照，測定篩選出的7種噬菌體與HO-8910PM的結合效率。結果顯示所獲得的噬菌體與HO-8910PM細胞表面的相對結合效率明顯高于對照噬菌體（10.7～69.0倍；平均39.8倍），其中噬菌體Z3與HO-8910PM細胞表面的結合效率是對照噬菌體的69.0倍（見表2）。

2.4 ELISA在ELISA實驗中，OD隨機克隆/OD陰性對照克隆（P/N）＞2.1時，即表示細胞與此克隆具有高親和力，而本實驗中噬菌體Z1、Z3的P/N＞2.1，且Z3噬菌體的P/N＞7。見圖1。

圖1 ELISA鑒定不同噬菌體克隆與三種腫瘤細胞的親和力

3 討論

噬菌體展示技術最大的優勢即實現了基因型和表型的結合，因而不需要預先知道任何肽類結構的信息，通過對親和篩選獲得的陽性克隆的基因進行序列測定，就可間接推導出所遞呈的外源多肽的氨基酸序列。近年來以噬菌體展示技術為手段開展抗腫瘤短肽的研究，己經取得了一些進展。Zhang等[11]用結腸癌細胞SW480和人正常的腸上皮細胞對噬菌體7肽庫進行多輪篩選，結果顯示CP15（VHLGYAT）與結腸癌細胞SW480結合率最高，而與正常的腸上皮細胞幾乎不結合，為診斷結腸癌和開發治療結腸癌藥物奠定了基礎。目前國內外針對抗卵巢癌短肽的研究只有少數報道。Zhang等[12]利用噬菌體隨機12肽庫篩選與卵巢癌細胞SK-OV-3特異性結合的小分子多肽，得到短肽ZP1（SVSVGMKPSPRP），初步認為是卵巢癌靶向治療和靶向診斷的一種配體肽段。

本研究亦采用噬菌體展示技術，但在此基礎上聯合應用體外快速差減篩選技術，能有效減少非特異性結合，提高篩選效率。經過5輪差減篩選，回收率從2.0×10-5增加至4.3×10-5。雖然高于10倍的富集度才是理想的，但高于兩倍常常就是顯著的，從DNA測序結果分析來看也證明存在噬菌體的富集。為進一步篩選所獲得的7種陽性噬菌體，我們采用噬菌體競爭結合實驗，以M13K07為內參照來研究陽性噬菌體與HO-8910PM細胞表面的結合效率，其可明顯克服眾多因素的影響，如加入噬菌體的數目，細胞數量，競爭結合實驗過程中離心、復蘇、測滴度等，因而可獲得較好的重復性。隨后利用ELISA鑒定HO-8910PM與噬菌體單克隆親和力，結果顯示Z1、Z3的P/N＞2.1，且Z3噬菌體的P/N＞7，而同種噬菌體不同腫瘤細胞之間的OD值之比＜2.1，由于腫瘤細胞均有轉移侵襲的特性，但不同腫瘤細胞轉移侵襲能力不同，故可以推測噬菌體Z3與這三種腫瘤細胞均有較高親和力，尤其對高轉移潛能卵巢癌細胞株HO-8910PM有較高親和力。

綜上所述，本研究以遺傳背景相同，轉移潛能不同的卵巢癌細胞株差減篩選出的噬菌體Z3，其表面展示的短肽LRLRNTR可能與卵巢癌轉移侵襲有關，可望能為卵巢癌的早期診斷、轉移復發及治療提供新的方向。未來我們還可以進一步鑒定高轉移卵巢癌細胞表面轉移相關分子結合肽的生物學功能，根據此多肽序列人工合成抗腫瘤藥物或者化學檢測藥物，進行動物體內的噬菌體展示實驗等。

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（本文編輯：吳健敏）

Screening metastasis related peptides binding to the surface of ovarian tumor cells by phage display

LI Wenju, WANG Ledan, LV Jieqiang.Department of Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: Using 7-mer phage display peptide library in vitro to isolate metastasis related peptides on the surface of the high metastatic potential ovarian tumor cell line HO-8910PM.Methods:Phage display technology with biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands between cell lines HO-8910 and HO-8910PM was utilized. After five rounds of biopanning, 14 phage clones were randomly selected for sequencing of DNA. Using ELISA and phage competitive binding experiment the affinity of positive phages combined with HO-8910PM cells was identified.Results:The phage clone named Z3 (peptide LRLRNTR) showed higher affinity to HO-8910PM cells.Conclusion:The peptide LRLRNTR screened by phage display technology may offer a new direction for early diagnosis, metastasis and treatment of ovarian tumor.

ovarian tumor; phage display technology; phage peptide library; peptides

R711.75

A

1000-2138（2014）02-0127-04

2013-10-15

李文桔（1988-），女，浙江溫州人，碩士生。

呂杰強，教授，Email：jieqianglu@126.com。