miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達及其臨床意義

許踐剛，林峰，張憲波，胡芝，王昭君，趙挺，沈潔

（1.溫州市中心醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.臺州市第一人民醫院 普外科，浙江 臺州 318020；3.溫州市中心醫院 婦瘤科，浙江 溫州 325000）

·論 著·

miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達及其臨床意義

許踐剛1，林峰2，張憲波1，胡芝3，王昭君1，趙挺1，沈潔2

（1.溫州市中心醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.臺州市第一人民醫院 普外科，浙江 臺州 318020；3.溫州市中心醫院 婦瘤科，浙江 溫州 325000）

目的：探討miR-195在乳腺浸潤性導管癌患者術前、術后2周血漿中的表達及其與乳腺癌臨床病理特征的相關性。方法：以miR-16為內參，采用莖環RT-qPCR方法檢測48例術前、術后2周乳腺浸潤性導管癌患者及35例健康對照者血漿中miR-195的表達，并分析其表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理指標的關系。結果：乳腺浸潤性導管癌患者血漿中miR-195的表達較健康對照者明顯升高（P＜0.05），術后2周表達明顯降低至健康對照者水平。ROC曲線顯示，血漿miR-195評價乳腺浸潤性導管癌的敏感性和特異性可達94.4%和68.8%。與臨床特征相關性分析統計未見血漿miR-195表達與乳腺浸潤性導管癌腫塊大小、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）狀態及淋巴結轉移狀態等臨床病理特征有明顯相關（P＞0.05）。結論：血漿中miR-195的異常表達可作為乳腺癌診斷的新的腫瘤標志物。

微RNAs；miR-195；乳腺腫瘤

近年來新發現的一類內源性微RNA，即microRNA（miRNA），長度只有22 nt左右，不編碼任何蛋白質，但能夠高效調控癌基因或抑癌基因的表達而在腫瘤的發生發展中起著關鍵的調控作用，是目前腫瘤研究領域的熱點。除外細胞內表達，在血清、眼淚、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、羊水等體液均可檢測到miRNA[1]。有研究發現，這些細胞外miRNA可通過exosome轉運至受體細胞發揮調控效應[2-5]，因此被認為是非常理想的腫瘤早期診斷和篩查、治療效果判斷、預后評價的手段。最近有報道稱miR-195的失調表達不但與腎上腺皮質腫瘤[6]、結腸癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]等相關，而且與乳腺癌[10-11]相關。但血漿miR-195表達與乳腺癌的關系鮮有研究。為此，本研究通過莖環RT-qPCR方法比較乳腺浸潤性導管癌患者及健康對照者血漿標本中miR-195的表達，并分析其術后2周時表達的變化及其與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料48例乳腺浸潤性導管癌術前及術后2周血漿標本采自2011年1月至2012年11月間溫州市中心醫院腫瘤外科及臺州市第一人民醫院普外科住院患者。所有患者均為女性，年齡31～78歲，平均（52.2±11.5）歲。所有患者均經病理確診，乳腺浸潤性導管癌組織病理的診斷標準參照WHO乳腺腫瘤的病理學分類。雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體-2（Her-2）的免疫組化判斷參照美國臨床腫瘤學會（ASCO）與美國病理家學會（CAP）的檢測指南。

1.2 材料Tri-Reagent BD試劑購自Sigma公司；ReverTra Ace反轉錄試劑盒、SYBR Mastermix等試劑購自Toyobo公司；DEPC水購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血漿收集：取枸櫞酸鈉抗凝的外周靜脈血5 mL，3 000 r/min、離心10 min，取血漿，進一步12 000 r/min、離心10 min后，將血漿置-80 ℃冰箱保存備用。同時收集同時期年齡匹配的、無腫瘤病史的健康對照者35例，同樣方法收集血漿備用。

1.3.2 血漿RNA提取：取血漿標本200 μL，加入1 μL 5 mg/mL糖原、20 μL 5 mol/L的冰醋酸及750μL的TRI Regent BD，充分混勻，按試劑說明書步驟抽提RNA。RNA沉淀經80%乙醇洗滌后，加入DEPC處理水20μL，-80 ℃保存。

1.3.3 miR-195表達檢測：根據Wu等[9]報道的miRNA檢測的莖環RT-qPCR方法，以miR-16作為內參，分析miR-195表達。相關分析的引物序列如表1所示。取5μL提取的RNA分別以miR-195及miR-16莖環RT引物進行反轉錄。反應條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，反應結束后-20 ℃保存。以15μL反應體系進行Real-time定量PCR。miRNA檢測反應體系包括：1 μL RT產物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特異前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。Realtime定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。Real-time定量PCR技術使用Applied Biosystems 7500儀器進行。所有樣品做3復孔。根據待測標本的Ct值，以miR-16作為內參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示標本中miR-195相對表達量，其中△Ct=CtmiR-195-CtmiR-16。以N=2-△△Ct表示手術后2周血漿miR-195表達相對于術前血漿標本的變化倍數，其中△△Ct=（CtmiR-195-CtmiR-16）術后-（CtmiR-195-CtmiR-16）術前。

表1 引物序列

1.4 統計學處理方法采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。miR-195表達數據以中位數和四分位數間距表示。配對樣本間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，兩組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗，ROC曲線分析敏感性和特異性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿miR-16及miR-195檢測特異性分析如圖1顯示，miR-16及miR-195的RT-PCR產物的熔解曲線為單峰，說明莖環RT-qPCR可以特異檢測miR-16及miR-195。

2.2 miR-195在乳腺浸潤性導管癌患者術前、術后2周及健康對照者血漿中的表達乳腺浸潤性導管癌患者術前、術后2周及健康對照者血漿中miR-195表達結果如圖2所示，提示乳腺浸潤性導管癌患者術前血漿miR-195表達明顯高于健康對照者（P＜0.001），術后2周明顯降低（P＜0.001）。術后2周與健康對照者相比差異無統計學意義（P＞0.05），其相對表達值分別為：5.12、2.20及2.66。

圖1 miR-195及miR-16莖環RT-qPCR熔解曲線

圖2 乳腺癌患者術前、術后2周及健康對照者血漿中miR-195表達水平

2.3 血漿miR-195作為乳腺癌患者篩選指標的評價

基于上述結果，我們進一步采用ROC曲線分析血漿miR-195表達篩選乳腺浸潤性導管癌的特異性和敏感性。如圖3所示，比較乳腺浸潤性導管癌患者及健康對照者血漿miR-195表達的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.884（95% CI=0.815～0.952，P＜0.001），提示血漿miR-195可作為乳腺浸潤性導管癌的篩選指標。以血漿miR-195相對表達量4.26作為評價臨界值判斷乳腺浸潤性導管癌的敏感性和特異性分別為94.4%和68.8%。

圖3 ROC曲線分析乳腺浸潤性導管癌患者血漿miR-195的表達

2.4 血漿miR-195表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系進一步分析血漿中表達上調的miR-195的相對表達量和腫瘤大小，ER、PR、Her-2狀態及淋巴結轉移狀態等乳腺浸潤性導管癌的臨床病理特征的相關性，結果顯示，血漿miR-195的表達水平與這些臨床病理特征無明顯相關（P＞0.05）。見表2。

表2 血漿miR-195表達和乳腺癌臨床病理因素的相關性分析

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤發生發展中發揮重要作用。乳腺癌的發生發展也是一個多基因改變的過程，同樣接受miRNA的調控作用。而腫瘤標志物是由腫瘤組織和細胞產生的與腫瘤形成、發生相關的物質，一種良好的腫瘤標志物對腫瘤的早期發現，判斷療效及預后等方面均有重要的意義。來自血液中的腫瘤標志物因其無創、高效尤其適用于臨床。近年來已發現許多與來自于腫瘤細胞本身的與乳腺癌TMN分期、血管侵犯、增殖指數、ER和/或PR狀態等預后因子相關的miRNA[12-13]，最近還發現miRNA可穩定存在于血清和血漿中[1]。為此，使用循環miRNA作為潛在的早期腫瘤篩選標記引起了人們的極大的興趣。最近的一些病例對照研究[14-17]發現了一些乳腺癌血液特征的miRNA。

miR-195屬于miR-15家族成員，基因位于17p13.1區域，與miR-497成簇分布。已經發現腫瘤組織miR-195表達失調與多種腫瘤關系密切。最近基于全血miRNA研究證明，乳腺癌患者全血系統的miR-195表達明顯高于健康對照者[18]，而且與前列腺癌、腎癌、結腸癌等比較，全血系統miR-195是乳腺癌具有相對特征性的miRNA[19]。但血漿miR-195的表達與乳腺癌臨床特征關系少有研究報道。

為分析miR-195在乳腺癌患者血漿中的表達及其臨床意義，本研究以miR-16為內參，應用莖環RT-qPCR技術檢測乳腺浸潤性導管癌患者術前、術后2周及健康對照者血漿中miR-195表達。與全血檢測結果類似，本研究乳腺浸潤性導管癌患者血漿miR-195表達明顯高于健康對照者。而且我們還發現，乳腺浸潤性導管癌患者術后2周血漿miR-195降低到健康對照者的水平。ROC曲線顯示血漿中miR-195的異常表達有較好的乳腺癌診斷價值，其敏感性和特異性可達94.4%和68.8%。但與臨床病理特征相關性分析統計未見血漿miR-195表達與乳腺浸潤性導管癌腫瘤大小、ER、PR、Her-2狀態及淋巴結轉移狀態等乳腺癌的臨床病理因素有明顯相關。

研究已證實，游離的miRNA容易被RNA酶降解，血漿中的miRNA主要通過外分泌泡（exosome）、Ago2蛋白、高密度脂蛋白等不同載體運輸[20]，但循環miRNA的起源迄今尚未完全闡明，曾經被認為來源于循環腫瘤細胞[21]、血液中血細胞[22]或疾病部位組織細胞[23]等。研究已經表明miR-195在乳腺癌組織中低表達[10]，而全血[18]及本研究的血漿中miR-195的檢測結果是明顯上調，提示乳腺癌患者血漿miR-195可能不是起源于腫瘤組織，其來源有待于進一步研究確定，但這并不影響其作為一種乳腺浸潤性導管癌血液學腫瘤標志物的良好潛質。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer and its clinical significance

XU Jiangang1,

LIN Feng, ZHANG Xianbo, HU Zhi, WANG Zhaojun, ZHAO Ting, SHEN Jie.1.Department of Oncological Surgery , Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of General Surgery, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou, 318020; 3.Department of Gynecologic Oncology, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou, 325000

Objective: To explore the expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer in preoperative and postoperative and two weeks and it correlation with clinicopathologic features of breast cancer.Methods:By normalized to miR-16, the expressions of miR-195 in 48 invasive ductal carcinoma of the breast cancer at preoperative and postoperative 2 weeks and 35 healthy controls were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-195 expression and clinicopathological characteristics were further analyzed.Results:Expression of miR-195 in plasma of patients with breast cancer was obviously higher than that in the healthy controls (P<0.05). At 2 weeks postopratively, a significant decrease of plasma miR-195 was observed, reaching levels of the healthy control subjects. ROC curve showed plasma levels of miR-195 could detect individuals with breast cancer with 94.4% sensitivity and 68.8% specificity. Correlative analysis of clinical features showed that there was no significant association between plasma miR-195 expression and the size of tumor, the state of ER, PR, lymph node metastasis and Her-2 receptor of breast cancer.Conclusion:Aberrant expression of miR-195 in plasma of breast cancer patients has potential use as novel noninvasive biomarkers for breast cancer. Key words:microRNA; miR-195; breast tumor

R730

A

1000-2138（2014）02-0105-05213112

2013-09-15

溫州市科技計劃項目（Y20110119）。

許踐剛（1973-），男，浙江泰順人，副主任醫師，醫學碩士。

沈潔，主任醫師，Email：Linfeng0316@aliyun. com。