ERK1/2在缺血再灌注損傷肺細(xì)胞凋亡中的作用及缺血后處理的干預(yù)

陳海娥，馬迎春，黃林靜，何金波，宋冬，鄭夢曉，應(yīng)磊，王萬鐵

（溫州醫(yī)科大學(xué) 缺血/再灌注損傷研究所、病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

ERK1/2在缺血再灌注損傷肺細(xì)胞凋亡中的作用及缺血后處理的干預(yù)

陳海娥，馬迎春，黃林靜，何金波，宋冬，鄭夢曉，應(yīng)磊，王萬鐵

（溫州醫(yī)科大學(xué) 缺血/再灌注損傷研究所、病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

目的：探究細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）在缺血/再灌注（IR）損傷肺細(xì)胞凋亡中的作用及缺血后處理的干預(yù)。方法：雄性SD大鼠，隨機(jī)分成5組（n=8），即對照組（C組）、肺缺血/再灌注組（IR組）、肺缺血/再灌注+缺血后處理組（IPO組）、缺血后處理+溶劑對照組（D組）、缺血后處理+U0126組（U組）。分別于再灌注2 h留取左肺組織，電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)改變；原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測肺細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）；RT-PCR法、免疫組化法測定肺組織Bax、Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與C組相比，IR組肺組織AI、Bax基因及蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），電鏡下肺細(xì)胞均發(fā)生明顯損傷；Bcl-2、Bcl-2/Bax基因及蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；IPO組、D組、U組與IR組相比，肺組織AI、Bax基因及蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），電鏡下肺細(xì)胞損傷情況有所改善；Bcl-2、Bcl-2/Bax顯著升高；D組與IPO組比較各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），U組與IPO組相比，肺組織AI值顯著升高（P＜0.05），電鏡下肺上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，胞內(nèi)細(xì)胞器不完整；Bcl-2基因及蛋白表達(dá)明顯降低，Bax基因及蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2/Bax顯著降低。結(jié)論：IR抑制了MAPK家族中的ERK1/2激活，導(dǎo)致大鼠肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，細(xì)胞大量凋亡；IPO可以通過激活ERK1/2通路，改善其結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞凋亡。

缺血/再灌注；缺血后處理；肺；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；U0126；Bcl-2；Bax；大鼠

隨著移植技術(shù)的廣泛開展，缺血/再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷成為了阻止移植成功的主要難題，肺缺血/再灌注是影響心肺移植成功與否的重大問題，其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與氧自由基損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載損傷及內(nèi)皮細(xì)胞的激活、炎性細(xì)胞的聚集激活、細(xì)胞黏附分子的釋放等因素有關(guān)[1]。缺血后處理（ischemic postconditioning，IPO）是在再灌注早期進(jìn)行的一系列快速的血流中斷/再通的過程，其可以改變再灌注血流動力學(xué)并對缺血再灌注器官產(chǎn)生保護(hù)作用，是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。已有研究表明IPO對肺IR有明顯的保護(hù)作用，但其機(jī)制仍不清楚[2]。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatd protein kinase，MAPK）家族的一員，其基本的信號傳遞步驟是：Ras-Raf-MEK-ERK。ERK通路在細(xì)胞增殖、分化、抗凋亡中發(fā)揮重要作用，可被多種刺激（如神經(jīng)遞質(zhì)、氧化應(yīng)激、缺血等）激活[3]。有研究表明ERK1/2在心臟IPO中被激活而發(fā)揮保護(hù)作用[4]，尚未有研究表明其是否在肺IPO中發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)意在探明ERK1/ 2在肺IPO中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克動物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SCXK（滬）2012-0002]。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核并同意實(shí)施。

1.2 主要試劑U0126（貨號U120，美國Sigma公司），原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（LOT：13033000，德國Roche公司），Trizol提取液（美國Life technologies公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas Life Science公司），PCR試劑盒（美國Fermentas Life Science公司），Bcl-2鼠多克隆抗體（美國santa cruz公司），Bax鼠多克隆抗體（美國santa cruz公司），即用型SABC過氧化物酶試劑盒（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），脫氧核糖核酸酶I（美國Sigma公司），其余均為市售分析純。

1.3 動物模型復(fù)制按照已發(fā)表文獻(xiàn)[2]報(bào)道的方法復(fù)制大鼠原位肺IR和IPO動物模型。大鼠稱重后，按8 mL/kg體質(zhì)量20%烏拉坦腹腔注射麻醉。麻醉后氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，行機(jī)械通氣，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為：潮氣量7～8 mL/kg，呼吸頻率70 b/min，吸呼比3:2。消毒左胸部皮膚，分離筋膜和肌肉，斷開第3、第4根肋骨，打開胸腔，暴露左肺，游離左肺門，動脈夾夾閉30 min，即為缺血期，松開動脈夾，即為再灌注期，再灌注時間為2 h，如此即成功復(fù)制在體原位單肺IR模型；再灌注前給予3個循環(huán)的缺血30 s/再灌注30 s處理，結(jié)束后再灌注2 h，即為IPO組。C組游離左肺門后不夾閉肺門，觀察2.5 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動物分為5組（每組8只）：對照組（C組），IR組，IPO組，IPO+0.4%二甲基亞砜（DMSO）的PBS溶液對照組（D組），IPO+U0126組（U組）。U0126用藥劑量為0.3 mg/kg體質(zhì)量，將0.3 mg U0126溶于7.5 mL 0.4% DMSO的PBS溶液中，使其充分溶解，缺血前尾靜脈注入大鼠體內(nèi)[5]，余處理同IPO組；D組于缺血前尾靜脈注入7.5 mL/ kg 0.4% DMSO的PBS溶液，余處理同IPO組。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取左肺組織標(biāo)本。

1.5 肺組織電鏡檢測依據(jù)文獻(xiàn)[6]所述方法進(jìn)行，即各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動物，取左肺近肺門處約1 mm×1 mm×1 mm大小的肺組織若干小塊，立即經(jīng)2.5%戊二醛前固定，再依次經(jīng)1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，酒精梯度脫水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，半薄切片和超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色后，于電鏡下觀察各標(biāo)本超微結(jié)構(gòu)改變。

1.6 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測依據(jù)文獻(xiàn)[7] Roche公司提供的試劑盒說明書所述方法進(jìn)行操作。凋亡細(xì)胞胞核經(jīng)DAB染色呈棕褐色，未凋亡細(xì)胞胞核復(fù)染后呈藍(lán)紫色。計(jì)數(shù)5個高倍鏡（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)。每張片子至少觀察500個細(xì)胞，計(jì)算每100個細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞，即凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.7 RT-PCR法測定肺組織Bax、Bcl-2基因的表達(dá)Trizol法提取肺組織總RNA。測定總RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。內(nèi)參及各目的基因的序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：起始變性，94 ℃，3 min；變性，94 ℃，30 s；退火，55 ℃（β-actin和Bax）/61.6 ℃（Bcl-2），30 s；延伸，72 ℃，1 min；終止延伸，72 ℃，5 min。循環(huán)數(shù)β-actin和Bax各30次，Bcl-2 33次。各目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為：β-actin：378 bp；Bax：337 bp；Bcl-2：411 bp。用各基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度比值（即Bcl-2 mRNA/β-actin mRNA、Bax mRNA/β-actin mRNA）表示各基因表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.8 免疫組化法檢測標(biāo)本中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平及其定位按照試劑盒所提供的說明書和文獻(xiàn)[8]中所述步驟進(jìn)行操作。標(biāo)本上呈棕褐色顯色的部分為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)。采用美國IPP6.0（Image-pro plus）彩色圖像分析系統(tǒng)測定陽性部位及背景的光密度值，以陽性部位的光密度值減背景的光密度值代表陽性部位的吸光度（optical density，OD）值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS17.0軟件。計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s t檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)性分析，采用Bivariate過程的Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化C組電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器清晰可見，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，未見核固縮碎裂或溶解；IR組超微結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重，可見核碎裂、溶解，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡I I型上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、脊消失，板層小體空泡化；IPO組和D組損傷有所減輕，未見明顯核碎裂、溶解，細(xì)胞間連接緊密，肺泡I I型上皮細(xì)胞內(nèi)板層小體數(shù)量尚可，未見明顯空泡化，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)無破壞；U組細(xì)胞結(jié)構(gòu)略有破壞，細(xì)胞間連接較疏松，部分細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)碎裂、溶解，核染色質(zhì)邊集，肺泡I I型上皮細(xì)胞微絨毛略有脫落，線粒體腫脹（見圖1）。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況及AI值的變化與C組（11.66 ±1.11）相比，IR組AI值（35.65±0.76）顯著升高，D組（25.74±0.94）、U組（30.86± 1.13）、IPO組（26.26±0.95）AI值顯著低于IR組（均P＜0.05），D組與IPO組相比無明顯差異（P＞0.05），U組顯著高于IPO組（P＜0.05）。凋亡細(xì)胞主要為肺泡上皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞（見圖2）。

2.3 肺組織Bax、Bcl-2基因表達(dá)水平的變化在C組Bcl-2呈高水平表達(dá)、Bax表達(dá)不明顯，IR組較C組Bcl-2表達(dá)明顯下降、Bax明顯上調(diào)，同時Bcl-2/Bax的比值降低（均P＜0.05）；與IR組比較，D組、U組、IPO組Bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Bax mRNA表達(dá)減弱，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05），D組與IPO組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；U組與IPO組比較，Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)上調(diào)，二者比值下降（見圖3）。

圖2 TUNEL法示各組肺組織細(xì)胞凋亡情況（×400）

圖3 ART-PCR法示Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)

圖3 B柱狀圖示Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值變化

2.4 肺組織 Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平的變化及定位在C組Bcl-2蛋白呈高水平表達(dá)，Bax蛋白表達(dá)不明顯，IR組表達(dá)較C組Bcl-2表達(dá)明顯下降，Bax明顯上調(diào)，同時Bcl-2/Bax的比值降低（均P＜0.05）；與IR組比較，D組、U組、IPO組Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)減弱，Bcl-2/Bax的比值增高（P＜0.05），D組與IPO組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），U組Bcl-2表達(dá)較IPO組明顯降低、Bax表達(dá)明顯升高，二者比值降低。Bcl-2與Bax陽性細(xì)胞主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞（見圖4-6）。

2.5 相關(guān)性分析肺組織AI與Bax基因及蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)（r分別為0.796，0.895，均P＜0.01，n=40）；肺組織AI與肺組織Bcl-2基因及蛋白、Bcl-2/Bax基因及蛋白呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.748，-0.797，-0.897，-0.960，均P＜0.01，n=40）。

3 討論

細(xì)胞凋亡又被稱為程序化細(xì)胞死亡，是細(xì)胞接受某種信號后或受到某些因素剌激后的一種主動的，由一些凋亡相關(guān)基因相互作用的細(xì)胞死亡過程。近年來，國內(nèi)外學(xué)者的大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡參與了肺IR損傷[1]。本實(shí)驗(yàn)中，IR組AI值較C組明顯升高，肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷較C組嚴(yán)重，這些充分證明了以上結(jié)論。

圖4 各組肺組織Bax蛋白表達(dá)情況（免疫組化法，×200）

圖5 各組肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)情況（免疫組化法，×200）

圖6 IPP6.0計(jì)算各組肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況及Bcl-2/Bax比值

Ng等[1]報(bào)道，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的途徑主要有死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體-細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt c）途徑（內(nèi)源性途徑）。其中外源性途徑通過特定的受體-配體相互作用，比如Fas/Fas-L、血管緊張素I I和腫瘤壞死因子（TNF）/受體，導(dǎo)致一系列的細(xì)胞內(nèi)凋亡級聯(lián)激活主要是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）；內(nèi)源性途徑主要是通過Bcl-2家族基因中的促凋亡基因Bax作用于線粒體膜表面，使其通透性改變，Cyt c和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）釋放，凋亡小體形成，激活caspases家族，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡與否主要是細(xì)胞內(nèi)的促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2相互作用，Bcl-2占優(yōu)勢時細(xì)胞存活，Bax占優(yōu)勢時細(xì)胞走向凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肺IR時， Bcl-2基因及蛋白表達(dá)下降，Bax基因及蛋白表達(dá)均升高，且Bcl-2/Bax比值下降；AI與Bax及Bcl-2/Bax基因及蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與Bcl-2基因及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致；而肺IPO中，Bcl-2基因及蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax基因及蛋白表達(dá)下降，AI減少，超微結(jié)構(gòu)下肺泡I I型上皮細(xì)胞胞膜及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，線粒體未發(fā)生水腫，線粒體脊清晰可見，結(jié)果表明了肺IPO可減輕肺IR的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。

更多的研究表明MAPKs家族在肺IR及其所致的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了不可忽視的作用[10-11]，而ERK1/2是MAPK家族的重要成員，目前ERK1/2的激活在細(xì)胞凋亡中究竟發(fā)揮何種調(diào)節(jié)機(jī)制仍有爭論，更多的研究認(rèn)為適度激活ERK1/2可以抑制凋亡的發(fā)生[12-14]。本室先前研究表明，肺IR時，抑制ERK1/2的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率明顯增加[8]。在心臟等器官IR中，ERKs被認(rèn)為有抗凋亡作用，對IR臟器有保護(hù)作用[15]。Darling等[4]研究表明，在多種在體和離體的心肌IR中，IPO可通過ERK1/2的激活來減輕IR引起的心肌結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)應(yīng)用ERK1/2特異性抑制劑U0126后，IPO中凋亡細(xì)胞數(shù)增多，即AI值增加，凋亡基因Bax占優(yōu)勢，說明阻斷ERK1/2后，IPO對IR的保護(hù)作用減弱。應(yīng)用U0126后，Bax與Bcl-2也發(fā)生了相應(yīng)的改變，這說明ERK1/ 2在內(nèi)源性凋亡途徑中處于Bcl-2/Bax的上游，很可能ERK1/2的激活促使Bcl-2/Bax發(fā)生相應(yīng)的改變，從而減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，IPO可激活肺組織ERK1/2，使抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)增加，而促凋亡基因Bax表達(dá)減弱，減輕了IR引起的肺組織結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞凋亡。

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（本文編輯：吳健敏）

Effects of ERK1/2 on pneumocyte apoptosis after lung ischemia/reperfusion injury and ischemic postconditioning

intervention

CHEN Haie, MA Yingchun, HUANG Linjing, HE Jinbo, SONG Dong, ZHENG Mengxiao, YING

Lei, WANG Wantie.Department of Pathophysiology, Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the role of ERK1/2 on pneumocyte apoptosis after lung ischemia/ reperfusion injury and ischemic postconditioning (IPO) intervention.Methods:Forty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups based upon the intervention (n=8): control group (C), IR group (IR), IR+IPO group (IPO), IPO+solution countrol group (D), IPO+U0126 group (U). Left lung tissue was isolated after the 2 hours of reperfusion, The ultrastructure of the left lung were observed under electron transmission microscopes. Apoptosis index (AI) of lung tissue was determined by terminal deoxynuleotidyl transferase mediated dUTP nick end and labeling (TUNEL) method. The mRNA expression and protein levels of Bcl-2 and Bax were measured by RT-PCR and quantitative immunohistochemistry (IHC).Results:Compared with C group, AI and the expression of Bax of IR were significantly increased, the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax were significantly decreased (P< 0.05), and ultrastructure abnormality was obviously found in lung tissue. Compared with IR group, all the indexes of IPO except for the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax were obviously reduced, the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax was increased (P<0.05). All the indexes between D and IPO were little or no significant (P>0.05). the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax of U was significantly decreased and other indexes were increased than those of IPO (P<0.05).Conclusion:IPO may attenuate pneumocyte apoptosis in LIRI by activation of ERK1/2 MAPK, up-regulating expression of Bcl-2/Bax ratio.

ischemia/reperfusion; ischemic postconditioning; lung; cell apoptosis; ERK1/2; U0126; Bcl-2; Bax; rats

R363

A

1000-2138（2014）02-0095-06

2013-09-22

溫州市高層次人才創(chuàng)新技術(shù)重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2 01 1-05）；浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2 01 2-X K-A 28）。

陳海娥（1986-），女，河北秦皇島人，碩士生。

王萬鐵，教授，博士生導(dǎo)師，Email：wwt@wzmc.edu.cn。