miR-34c對I I型子宮內膜癌HEC-1-B細胞生長和凋亡的影響

李甫鑰，薛紀森，黃亦波，陳慧君，鄭飛云

（溫州醫科大學附屬第一醫院 婦科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

miR-34c對I I型子宮內膜癌HEC-1-B細胞生長和凋亡的影響

李甫鑰，薛紀森，黃亦波，陳慧君，鄭飛云

（溫州醫科大學附屬第一醫院 婦科，浙江 溫州 325015）

目的：研究miR-34c對Ⅱ型子宮內膜癌HEC-1-B細胞的生長及凋亡的影響。方法：用hsa-miR-34c mimics轉染HEC-1-B細胞。流式細胞技術測定細胞轉染率，實時熒光定量PCR驗證轉染后miR-34c的表達。CCK-8檢測細胞增殖能力的改變。細胞克隆形成實驗觀察miR-34c對細胞生長的長期抑制。流式細胞技術測細胞凋亡。結果：細胞轉染率為81.16%。相對于對照組，轉染后實驗組miR-34c表達明顯增加，細胞增殖、克隆形成能力減弱，凋亡增加（P＜0.05）。結論：miR-34c能明顯抑制Ⅱ型子宮內膜癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，是Ⅱ型子宮內膜癌的潛在抑癌基因。

miR-34c；Ⅱ型子宮內膜腫瘤；細胞；增殖；凋亡

子宮內膜癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率正逐年上升[1-2]。手術是目前子宮內膜癌的主要治療方法。根據組織學特征、生物學表現及臨床預后等，子宮內膜癌分為I型和I I型兩種類型[3]。I型子宮內膜癌為雌激素受體陽性的高分化子宮內膜樣腺癌，占子宮內膜癌的80%左右，一般預后較好；I I型為雌激素受體陰性的子宮內膜癌，較少見，主要包括漿液性腺癌、透明細胞癌及其他低分化癌[4]，分化較差，預后不良。因此，尋找新的治療方法對于改善I I型子宮內膜癌的預后具有重大意義。微RNA（miRNA）是一種長約18～24個核苷酸的非編碼小RNA，通過對mRNA剪切或翻譯抑制來調節基因表達[5]。最近研究發現miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與多種癌的發生和發展（包括胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、淋巴瘤等）[6]。miRNA為腫瘤的治療提供了新的思路，并可能在分子水平對未來腫瘤治療產生巨大的影響。我們以前的研究[7]通過基因芯片技術對子宮內膜癌miRNA表達譜進行分析發現相對于正常子宮內膜，miR-34c在I I型子宮內膜癌中呈明顯低表達，提示miR-34c可能是I I型子宮內膜癌的抑癌基因之一。本研究通過上調I I型子宮內膜癌細胞的miR-34c表達并對其生物學功能的改變進行檢測，從而進一步了解miR-34c在I I型子宮內膜癌發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器hsa-miR-34c mimics（5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’）、miRNA mimics陰性對照（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）及FAM標記的hsa-miR-34c mimics（上海吉瑪公司），hsa-miR-34c上游引物（5’-AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC-3’）及U6上游引物（5’-CGCAAGGATGACACGCAAATTC-3’）（Invitrogen公司），胎牛血清、低糖DMEM培養液（Gibco公司），lipofectamine 2000轉染試劑、CCK-8試劑（碧云天生物技術研究所），Trizol試劑、miRNA反轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒（Invitrogen公司），SYBR GREEN（TOYOBO公司）；ELX800酶標儀（美國BIO-TEK公司），Applied Biosysystems 7500型實時定量PCR儀（美國ABI公司），FACSCalibur流式細胞儀（美國B-D公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞系的選擇及培養：HEC-1-B細胞系為雌激素受體ERα及ERβ均陰性的細胞系[8]，根據I I型子宮內膜癌雌激素受體陰性的分類標準，我們選擇HEC-1-B細胞（購自中科院上海細胞庫）作為I I型子宮內膜癌細胞系。

HEC-1-B細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃含5% CO2的培養箱內培養。細胞呈貼壁生長，待細胞生長至培養瓶面積的90%以上時用胰酶消化，收集細胞，離心、重懸后，按1:3傳代。

1.2.2 細胞的轉染及轉染率檢測：轉染前24 h按約2×105個/孔的量將細胞接種于6孔板（96孔板接種2 500個/孔），24 h后細胞覆蓋約30%～50%的孔底面積時，按照lipofectamine 2000試劑說明書操作分別轉染hsa-miR-34c mimics和NC。實驗分三組：實驗組（轉染hsa-miR-34c mimics）、NC組（轉染miRNA mimics陰性對照）、空白組（不轉染）。轉染后置于培養箱中繼續培養。

轉染FAM標記的hsa-miR-34c mimics（記為FAM組），24 h后用熒光顯微鏡觀察細胞內的熒光，拍照。將獲取的細胞用PBS洗滌、離心、重懸后，避光。用流式細胞儀檢測帶熒光的細胞量，通過與空白組的比較得出細胞的轉染率。

1.2.3 RNA提取及實時熒光定量PCR測定miR-34c的表達：用6孔板鋪板、轉染后48 h，用Trizol試劑提取總RNA（其中包含miRNA），用核酸蛋白分析儀測定RNA純度，保證A260/A280在1.8～2.0范圍內。根據miRNA反轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒說明，對提取的RNA中的miRNA加多聚A尾，然后進一步反轉錄為cDNA。完成反轉錄后，以U6作為內參進行下一步的實時定量熒光PCR，反應為10 μ L體系：5μ L的SYBR-Green試劑、1μ L濃度為1μmol/ L的特異性miR-34c或U6上游引物、1 μL濃度為1 μmol/L的下游通用引物（試劑盒內提供）、1μL之前合成的cDNA模板（1:10稀釋后），2μ L的DEPC水。將反應體系置于實時定量PCR儀內進行反應。反應條件：95 ℃變性3 min后，擴增40個循環（每個循環95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min）。反應完成后，根據各組的miR-34c及內參U6的CT值用2-△△Ct法計算每組miR-34c的相對表達量。

1.2.4 CCK-8測細胞增殖：轉染前24 h，以2 500個細胞/孔的濃度鋪96孔板，每組設3個復孔。24 h后轉染（方法同前述），轉染后置于培養箱繼續培養。培養96 h后用不含血清的DMEM培養液換液，每個孔各加10 μ L的CCK-8試劑，置于培養箱1 h后用酶標儀測定每個孔450 nm波長的吸光度，通過比較實驗組與NC組及空白組的吸光度來反映有活性的細胞數量的差別。

1.2.5 細胞克隆形成實驗：為進一步觀察miR-34c對細胞生長的長期抑制作用，我們對轉染后細胞的克隆形成能力進行研究。鋪板、轉染后72 h，胰酶消化、收集、離心各組細胞，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸。細胞計數后，以800個細胞/孔的濃度鋪6孔板，混勻，使細胞均勻地分布于孔的底部。置于培養箱培養，每3～4 d換培養液，約14 d后，細胞在孔底形成肉眼可見的細胞團塊。用結晶紫染液對細胞團染色30 min，PBS洗滌2～3次后，拍照、計數。

1.2.6 流式細胞技術測細胞凋亡：鋪6孔板、轉染后72 h，胰酶消化、收集、離心各組細胞，棄上清，PBS洗滌、離心2次，根據Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒的說明，使用100μ L緩沖液重懸細胞，用5 μ L的Annexin V和1 μ L的PI對細胞進行染色15 min，再用400μ L緩沖液稀釋。用流式細胞儀測定細胞的凋亡。

1.3 統計學處理方法采用SPSS 19.0統計學軟件。各組數據比較采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗進行兩兩比較。每個實驗至少重復3次，結果以±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染效率細胞轉染FAM標記的hsa-miR-34c mimics 24 h后，在熒光顯微鏡下可見明顯的細胞內熒光（見圖1A）。通過流式細胞技術比較實驗組與空白組帶熒光細胞量（見圖1B），實驗組的轉染效率為81.16%。

圖1 轉染后24 h細胞熒光及轉染效率

2.2 轉染后細胞miR-34c的表達上調轉染48 h后，通過實時熒光定量PCR測定miR-34c的相對表達量，根據圖2A和圖2B的融解曲線判斷，miR-34c及U6的引物特異性較好，可認為PCR結果可靠。用2-△△Ct法計算miR-34c相對表達量顯示：實驗組為373.43±74.95，NC組為1.01±0.19，空白組為1.14±0.16。實驗組的miR-34c表達量明顯高于NC組及空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖2C）。

2.3 轉染miR-34c能抑制細胞的增殖轉染96 h后，加入CCK-8后，用酶標儀測得每組的450 nm波長的吸光度，結果顯示：實驗組為0.56±0.02，NC組為1.00±0.04，空白組為1.03±0.02。實驗組細胞增殖明顯受抑制，抑制率約為44%，與NC組及空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖3）。

2.4 miR-34c抑制細胞克隆的形成細胞生長14 d后，實驗結果如圖4A，實驗組的細胞克隆形成能力明顯下降。統計細胞克隆數（見圖4B），實驗組細胞克隆數明顯少于NC組和空白組（實驗組為48.7 ±2.5，NC組為149.6±4.0，空白組為143.0± 2.6），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 實時熒光定量PCR檢測miR-34c的表達情況（2-△△Ct法）

圖3 轉染后96 h細胞增殖情況（450 nm波長）

2.5 miR-34c促進細胞凋亡轉染72 h后，流式細胞技術測細胞的凋亡（見圖5），右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，兩者之和為細胞總的凋亡。實驗組細胞凋亡率高于NC組和空白組（實驗組為11.96±0.90，NC組為5.05±0.43，空白組為5.25±0.83），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 細胞克隆形成實驗

3 討論

miRNA為近年來腫瘤治療的研究熱點。越來越多的研究顯示其通過轉錄后水平調節腫瘤相關蛋白表達，顯著改變多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、細胞周期及侵襲能力等[6，9]，在腫瘤診斷及治療方面有著極大的潛力。

近年來研究發現miR-34家族成員（包括miR-34a、miR-34b和miR-34c）是p53抑癌基因的靶點，通過與p53的相互作用而起到抑癌作用[10]。研究證實miR-34家族參與多種腫瘤的形成與發展，包括肝癌、結腸癌、卵巢癌、神經母細胞瘤及白血病等[11-12]。目前，關于miR-34c對子宮內膜癌的生物學作用的研究甚少，尤其是對I I型子宮內膜癌的作用國內鮮見相關報道。

在分子學水平理解腫瘤的發病機制是成功找到新的治療方法的重要途徑[13]。子宮內膜癌I I型較I型少見，但是預后明顯比I型差，病死率高，有學者認為這與I I型子宮內膜癌的高侵襲性和高復發率相關[14]。但從分子水平考慮其預后差是否與miRNA相關還不清楚，鑒于我們之前研究發現的miR-34c在I型子宮內膜癌中的表達與正常子宮內膜無明顯差別，而在I I型子宮內膜癌中呈明顯低表達[7]，我們認為I型和I I型子宮內膜癌預后的差別可能與miR-34c相關。為進一步研究miR-34c的抑癌作用，本研究通過轉染hsa-miR-34c mimics上調I I型子宮內膜癌HEC-1-B細胞miR-34c的表達。流式細胞技術測定轉染率達80%以上。實時熒光定量PCR再次驗證，結果顯示實驗組miR-34c表達明顯上調，與流式細胞技術結果一致，證實轉染成功。用CCK-8試劑測細胞增殖能力的改變，發現細胞增殖明顯被抑制。細胞克隆形成實驗證實miR-34c對I I型子宮內膜癌有長期抑制作用。更重要的是，流式細胞技術測凋亡發現miR-34c也能促進細胞凋亡。通過實驗的觀察，我們發現細胞的凋亡能進一步抑制細胞增殖及細胞克隆形成能力。根據以上結果，我們認為miR-34c是I I型子宮內膜癌的潛在抑癌基因。

Tanaka等[15]對間皮細胞中miR-34的作用進行研究，證明miR-34通過調節MET蛋白表達抑制細胞增殖，并調節Bcl-2蛋白的表達促進細胞凋亡。這與我們在II型子宮內膜癌中觀察到的結果一致，但miR-34c在I I型子宮內膜癌中的作用機制及其是否也與MET和Bcl-2有關仍需進一步研究證明。

綜上所述，miR-34c能明顯抑制I I型子宮內膜癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，并可能與I I型子宮內膜癌的預后差相關。miR-34c作為I I型子宮內膜癌的潛在抑癌基因，可能為將來I I型子宮內膜癌在分子水平的早期診斷及治療提供新的方法，成為手術之外更有效的治療方法之一。但目前大部分miRNA的作用機制尚未研究清楚，miR-34c的作用機制還有待進一步研究。

圖5 流式細胞技術測凋亡

[1]Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1): 10-29.

[2]Ueda SM, Kapp DS, Cheung MK, et al. Trends in demographic and clinical characteristics in women diagnosed with corpus cancer and their potential impact on the increasing number of deaths[J]. Am J Obstet Gynecol, 2008, 198(2): 218.e1-218.e6.

[3]Bokhman JV. Two pathogenetic types of endometrial carcinoma[J]. Gynecol Oncol, 1983, 15(1): 10-17.

[4]Tergas AI, Buell-Gutbrod R, Gwin K, et al. Clinico-pathologic comparison of type II endometrial cancers based on tamoxifen exposure[J]. Gynecol Oncol, 2012, 127(2): 316-320.

[5]Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[6]Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6(4): 259-269.

[7]薛紀森, 張乾, 李曉琳, 等. 子宮內膜癌I型和II型miRNA表達譜差異的分析[J]. 實用醫學雜志, 2011, 27(22): 4051-4054.

[8]孫蓬明, 魏麗惠, 高敏, 等. 雌激素受體相關受體α過度表達對雌激素受體陰性的子宮內膜癌細胞增殖的影響[J]. 中華婦產科雜志, 2007, 42(6): 408-411.

[9]Le XF, Merchant O, Bast RC, et al. The roles of microRNAs in the cancer invasion-metastasis cascade[J]. Cancer microenviron, 2010, 3(1): 137-147.

[10]Bommer GT, Gerin I, Feng Y, et al. p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes[J]. Curr Biol, 2007, 17(15): 1298-1307.

[11]Son MS, Jang MJ, Jeon YJ, et al. Promoter polymorphisms of pri-miR-34b/c are associated with hepatocellular carcinoma[J]. Gene, 2013, 524(2): 156-160.

[12]Wong MY, Yu Y, Walsh WR, et al. microRNA-34 family and treatment of cancers with mutant or wild-type p53 (Review)[J]. Int J Oncol, 2011, 38(5): 1189-1195.

[13]Yeramian A, Moreno-Bueno G, Dolcet X, et al. Endometrial carcinoma: molecular alterations involved in tumor development and progression[J]. Oncogene, 2013, 32(4): 403-413.

[14]Mendivil A, Schule K, Gehrig P, et al. Non-endometrioid adenocarcinoma of the uterine corpus: a review of selected histological subtypes[J]. Cancer Control, 2009, 16(1): 46-52.

[15]Tanaka N, Toyooka S, Soh J, et al. Downregulation of microRNA-34 induces cell proliferation and invasion of human mesothelial cells[J]. Oncol Rep, 2013, 29(6): 2169-2174.

（本文編輯：吳健敏）

The influence of miR-34c on growth and apoptosis of type II endometrial carcinoma cell line HEC-1-B

LI Fuyao, XUE Jisen, HUANG Yibo, CHEN Huijun, ZHENG Feiyun.Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the effect miR-34c on the growth and apoptosis of type II endometrial carcinoma cells (HEC-1-B cell line).Methods:Up-regulated the expression of miR-34c by transfecting cells with hsa-miR-34c mimics, the transfection efficiency was detected by flow cytometry and further verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Cell proliferation assay by CCK-8 and colony formation assay applied to demonstrate that miR-34c could inhibit the growth of HEC-1-B cells. Cells apoptosis assay was analyzed by flow cytometry.Results:The transfection efficiency was 81.16%. The overexpression of miR-34c (detected by qRT-PCR) could inhibit cell proliferation, colony formation and promote cells apoptosis (P <0.05).Conclusion:MiR-34c can inhibit the growth and promote apoptosis of HEC-1-B cells significantly, and function is a potential tumor suppressor in type II endometrial carcinoma.

miR-34c; type II endometrial carcinoma; cell; proliferation; apoptosis

R711

A

1000-2138（2014）02-0086-05

2013-09-25

浙江省自然科學基金資助項目（Y2 090 69 9）。

李甫鑰（1989-），男，浙江蒼南人，碩士生。

鄭飛云，主任醫師，碩士生導師，Email：zfy5710 @163.com。