14-3-3γ表達載體的構建及其對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響

沈奇，張文文，陶雪嬌，段萍，朱雪瓊

（溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

14-3-3γ表達載體的構建及其對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響

沈奇，張文文，陶雪嬌，段萍，朱雪瓊

（溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江 溫州 325027）

目的：構建一種穩定、高表達的14-3-3γ基因真核表達質粒載體，并探索其抗子宮肌瘤的作用。方法：提取子宮肌瘤細胞總RNA，反轉錄后通過RT-PCR擴增14-3-3γ，并將擴增的目的基因片段插入pCMVN-Flag真核表達質粒，構建重組質粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag，重組體經限制性內切酶酶切分析及測序鑒定后，用脂質體轉染技術導入子宮肌瘤細胞。應用Western Blot法檢測14-3-3γ蛋白的表達，應用CCK-8檢測細胞增殖變化，應用Annexin V-FITC/PI雙染色法經流式細胞術檢測細胞凋亡。結果：①構建的14-3-3 γ-pCMV-N-Flag真核表達載體經酶切后電泳和DNA測序，顯示載體構建正確；②子宮肌瘤細胞轉染重組體后的14-3-3γ表達明顯高于轉染前（P＜0.05）；③子宮肌瘤細胞轉染重組體后，細胞增殖抑制率為52.90%（P＜0.05）；④轉染重組體后肌瘤細胞的凋亡率明顯高于轉染前（P＜0.05）。結論：本研究成功構建14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表達質粒載體，14-3-3γ在子宮肌瘤細胞內高表達后可抑制細胞的增殖和促進細胞凋亡。

子宮肌瘤；載體構建；增殖；凋亡

14-3-3蛋白是一類高度保守的酸性蛋白家族，目前已發現14-3-3蛋白在哺乳動物中有七種亞型，分別為：β、γ、ε、η、ζ、σ和τ。該蛋白能夠與細胞內200多種蛋白質結合，參與細胞信號傳導、周期調控、凋亡、分化、惡性轉化、遷移等多種細胞生命活動，在腫瘤的發生發展中發揮多方面的作用[1]。

子宮肌瘤是女性生殖器官最常見的腫瘤，雖是良性腫瘤，卻是導致生育年齡婦女子宮切除的首位原因[2]，嚴重危害了婦女的生殖健康。在我們的前期研究中，率先應用雙向凝膠電泳和電噴霧串聯質

譜技術研究子宮肌瘤和周圍正常肌層組織的差異蛋白質，并采用RT-PCR技術和免疫印跡（Western Blot）法進一步驗證，發現14-3-3 γ在子宮肌瘤中的表達明顯低于正常子宮肌層組織[3]，但14-3-3 γ在子宮肌瘤發生發展中的具體作用機制尚不明確。為此，本研究擬通過質粒轉染技術，構建人子宮肌瘤14-3-3γ高表達載體，探討14-3-3 γ對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響，為治療子宮肌瘤提供新思路和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 子宮肌瘤和質粒：標本取自2012年4月至2013年4月本院婦科因子宮肌瘤而住院行子宮全切或次全切除術的患者共10例。術后病理證實為普通型平滑肌瘤。本研究經本院倫理委員會批準，每例納入實驗的患者均簽署知情同意書?？蛰d體pCMV-NFlag購自碧云天生物技術有限公司。

1.1.2 工具酶及主要試劑：內切酶BamHI、EcoRI及T4 DNA連接酶均購自美國Thermo公司。PCR產物純化試劑盒及質粒大提試劑盒購自美國Generay公司。反轉錄試劑盒、Lipofectamin 2000及Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司。 II型膠原酶、DMEM培養基購自美國Gibco公司。鼠抗人14-3-3γ一抗購自美國Santa Cruz公司。CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所。

1.1.3 引物：根據GenBank數據庫中14-3-3γ的全基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計有酶切位點的上、下游引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成。14-3-3 γ基因引物序列為，上游：5’-CGCGGATCC ATGGTGGACCGCGAGCAACTG-3’（BamHI），下游：5’-CCGGAATTC TTAATTGTTGCCTTCGCCGC-3’（EcoRI），加線部分分別為BamHI和EcoRI酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 重組14-3-3γ載體的構建：①14-3-3γ基因的獲得：提取子宮肌瘤細胞總RNA。按反轉錄試劑盒提供的方法合成14-3-3 γcDNA第l鏈，然后以cDNA為模板，擴增14-3-3γ基因片段。PCR反應條件：擴增14-3-3γ基因片段，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸l min，35個循環；68 ℃終延伸4 min，產物進行電泳分析。②14-3-3γ基因與pCMV-N-Flag質粒的連接：純化PCR產物，雙酶切PCR產物和pCMV-N-Flag質粒，去磷酸化，用T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化感受態大腸埃希菌DH5α，然后進行抗生素篩選，搖菌，提取質粒，酶切鑒定，測序鑒定。

1.2.2 人子宮肌瘤細胞原代培養：①術中無菌操作取子宮肌瘤組織約2 cm3，立即置于冰浴的DMEM中，迅速送至實驗室。②無菌PBS和DMEM培養基反復沖洗，剪碎后加入含0.2%的I I型膠原酶的DMEM培養基，于37 ℃振蕩消化3～5 h。 ③加完全培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再次加完全培養基，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。 ④再加入適量完全培養基，輕輕吹打成細胞懸液，以2×105個/mL密度接種，置37 ℃、飽和濕度、5% CO2環境下培養，隔天換液，5～7 d以1:2傳代。

1.2.3 細胞轉染：①細胞培養：取6孔培養板，向每孔中加入2 mL含1×105～2×105個細胞培養液，37 ℃ CO2培養至40%～60%融合。②轉染液制備：在EP管中制備以下兩液（為轉染每一個孔細胞所用的量）。A液：用不含血清培養基稀釋1～10μ g DNA，終量100 μL；B液：用不含血清培養基稀釋2～10 μL脂質體（Lipofectamine 2000），終量100μL。輕輕混合A、B液，室溫中置15～20 min。③轉染準備：用2 mL不含血清培養液漂洗兩次，再加入2 mL不含血清培養液。④轉染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37 ℃溫箱置6 h，吸除無血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。

1.2.4 Western Blot法檢測14-3-3γ蛋白的表達：①用細胞裂解液裂解細胞，二喹啉甲酸法（BCA法）測定蛋白含量。②用12% SDS-PAGE（15μ L/道）將蛋白質電轉移到聚偏二氟乙烯（pol-yvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗（14-3-3γ，1:1 000；內參Tubulin，1:2 000），4 ℃過夜。③TBST洗膜15 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，TBST洗膜15 min ×3次，ECL試劑與膜作用1 min后，用美國Bio-Rad公司的圖像攝取系統保存圖像并分析。④計算14-3-3 γ與Tubulin產物吸光度積分的比值，作為14-3-3γ蛋白的表達水平。每例實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖：①在96孔板中分三組，第一組、第二組每孔均配置100μ L的子宮肌瘤細胞懸液，細胞數為5 000個/100μ L，第三組每孔僅配置不含細胞的培養基。將培養板在培養箱預培養（37 ℃，5% CO2）24～48 h，至細胞80%融合。采用脂質體轉染技術，向第一組、第二組細胞分別轉染重組體和空載體，繼續培養24 h。②向每孔加入10μL CCK-8溶液。③將培養板在培養箱內孵育4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。每組設5個復孔，獨立實驗重復3次，取均值。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法經流式細胞術檢測細胞凋亡：①用不含EDTA的胰酶消化收集子宮肌瘤細胞，離心，微量離心機轉速1 000 r/min，離心時間5 min，棄培養基。②用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次（1 000 r/min，離心5 min收集細胞）。③用400 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106cells/mL。④在細胞懸浮液中加入5μL Annexin V-FITC和1μL 100μ g/mL PI輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min。⑤在1 h內用流式細胞儀檢測。每組設3個重復樣本，獨立實驗重復3次，取均值。

1.3 統計學處理方法采用SPSS17.0統計軟件對數據進行統計學分析。各組資料均為正態分布資料，因此數據以±s表示。兩組均數間比較采用配對t檢驗。多均數比較采用方差分析，均數間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag的構建與鑒定

重組14-3-3γ-pCMV-N-Flag經EcoRI單酶切后可見約5 048 bp長度的片段，與重組基因長度相符，經BamHI/EcoRI雙酶切后電泳可見約745 bp和4 303 bp長度的片段，與目的基因和空載體長度相符，見圖1。委托上海英俊生物有限公司對重組基因從正反兩個方向進行測序，通過Blast軟件分析測序結果，證實插入片段為14-3-3γ擴增片段，且插入方向正確，截取部分正向鏈和反向鏈序列圖，見圖2。

圖1 單酶切與雙酶切14-3-3γ-pCMV-N-Flag的鑒定結果

圖2 截取部分基因測序的正向鏈和反向鏈序列圖

2.2 轉染后子宮肌瘤細胞14-3-3 γ蛋白表達的變化

采用脂質體轉染技術，將重組質粒14-3-3 γ-pCMVN-Flag轉入體外原代培養的子宮肌瘤細胞，36 h后提取細胞蛋白，檢測14-3-3γ蛋白表達水平，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），轉染后14-3-3γ蛋白表達水平較轉染前升高，表明轉染成功，見圖3。

圖3 Western Blot法檢測子宮肌瘤細胞轉染前后14-3-3γ蛋白表達的變化

2.3 轉染后子宮肌瘤細胞增殖的變化子宮肌瘤細胞轉染14-3-3 γ-pCMV-N-Flag體外培養24 h后，細胞增殖抑制率為52.90%（P＜0.05）。表明14-3-3γ經轉染在子宮肌瘤細胞內表達增高后，有抑制肌瘤細胞增殖的作用。

2.4 轉染后子宮肌瘤細胞凋亡的變化圖4為重組體轉染子宮肌瘤細胞后的雙變量流式細胞儀的散點圖，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。經統計，未轉染的子宮肌瘤細胞有0.201±0.011處于凋亡狀態，轉染空載體的細胞有0.325±0.009處于凋亡狀態，轉染重組體的細胞有0.394±0.010處于凋亡狀態。與未轉染組相比，轉染重組體與轉染空載體的子宮肌瘤細胞的凋亡率明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。轉染重組體子宮肌瘤細胞的凋亡率明顯高于轉染空載體組（P＜0.01），表明轉染14-3-3γ重組體后，子宮肌瘤的細胞凋亡率增高。

圖4 流式細胞儀檢測重組體轉染后子宮肌瘤細胞的凋亡情況

3 討論

近年來，子宮肌瘤患病率有逐年增加的趨勢[2，4]。其發生與雌、孕激素密切相關[5]，但其發生發展的分子機制尚未明確。因此，深入探討子宮肌瘤發生發展的分子機制，將為有效治療子宮肌瘤提供新思路和實驗依據。

14-3-3蛋白與腫瘤發生發展的關系近年來受到學者們的重視，包括其與乳腺癌、卵巢癌的復發和轉移之間的相關性[6-7]。國外學者采用質粒轉染技術研究14-3-3β和14-3-3ζ對細胞功能和腫瘤細胞生物學行為的影響[8-9]。在我們的前期研究中，采用差異蛋白質組學技術發現14-3-3γ在子宮肌瘤中的表達明顯低于正常子宮肌層組織[3]，但14-3-3γ在子宮肌瘤發生發展中的作用尚未明確。

因此，本實驗首先將目的基因構建在真核細胞表達載體pCMV-N-Flag，成功構建重組質粒14-3-3 γpCMV-N-Flag。經限制性核酸內切酶酶切鑒定和DNA測序證實目的基因14-3-3γ序列正確，目的基因正確地構建在多克隆位點BamH I、EcoRI之間，開放閱讀框架正確。然后將重組質粒轉染到原代培養的子宮肌瘤細胞，用Western Blot法檢測轉染效果，結果顯示轉染后細胞的14-3-3 γ蛋白表達明顯增高。子宮肌瘤細胞轉染14-3-3γ重組質粒使細胞高表達14-3-3 γ后，細胞增殖明顯被抑制，而細胞凋亡率明顯增加，說明14-3-3 γ有抑制子宮肌瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的作用。本實驗為進一步研究14-3-3γ的抗子宮肌瘤的作用及其相關的信號傳導通路奠定了基礎，也為有效治療子宮肌瘤提供了新思路和實驗依據。

[1]Tzivion G, Gupta VS, Kaplun L, et al. 14-3-3 proteins as potential oncogenes[J]. Semin Cancer Biol, 2006, 16(3): 203-213.

[2]Nierth-Simpson EN, Martin MM, Chiang TC, et al. Human uterine smooth muscle and leiomyoma cells differ in their rapid 17 beta-estradiol signaling: implications for proliferation[J]. Endocrinology, 2009, 150(5): 2436-2445.

[3]Lv JQ, Zhu XQ, Dong K, et al. Reduced expression of 14-3-3 gamma in uterine leiomyoma as identified by proteomics [J]. Fertil Steril, 2008, 90(5): 1892-1898.

[4]金慧佩, 余方芳, 趙雅萍, 等. 不同因素對子宮肌瘤HIFU治療療效影響的初步分析[J]. 溫州醫學院學報, 2013, 43(6): 379-382.

[5]Hoekstra AV, Sefton EC, Berry E, et al. Progestins activate the AKT pathway in leiomyoma cells and promote survival [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2009, 94(5): 1768-1774.

[6]Bergamaschi A, Frasor J, Borgen K, et al. 14-3-3ζ as a predictor of early time to recurrence and distant metastasis in hormone receptor-positive and -negative breast cancers [J]. Breast Cancer Res Treat, 2013, 137(3): 689-696.

[7]Ravi D, Chen Y, Karia B, et al. 14-3-3σ expression effects G2/M response to oxygen and correlates with ovarian cancer metastasis[J]. PLoS One, 2011, 6(1): e15864.

[8]Park SG, Jung S, Ryu HH, et al. Role of 14-3-3-beta in the migration and invasion in human malignant glioma cell line U87MG[J]. Neurol Res, 2012, 34(9): 893-900.

[9]Kao GS, Chuang JY, Cherng CF, et al. Accumbal 14-3-3ζ protein downregulation is associated with cocaine-conditioned memory[J]. Neurosignals, 2011, 19(4): 175-188.

（本文編輯：吳健敏）

Construction of a 14-3-3γ expression vector and its effect on proliferation and apoptosis of uterine lei-

omyoma cells

SHEN Qi, ZHANG Wenwen, TAO Xuejiao, DUAN Ping, ZHU Xueqiong.Department of

Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To construct stably and highly expressing 14-3-3γ gene eukaryotic expression plasmid vector and to explore its antitumor effects on uterine leiomyoma cells in vitro.Methods:The total RNA was isolated from the uterine leiomyoma cells. After reverse transcription reaction, 14-3-3γ was amplified by RTPCR. The PCR product was cloned into the eukaryote expression vector pCMV-N-Flag, the resulted recombinant was designated as 14-3-3γ-pCMV-N-Flag. After sequence determination, the recombinant vector was transfected into uterine leiomyoma cells by lipofectin. The expression of the interesting protein was confirmed by Western Blot analysis. Cell proliferation was assessed by cell counting kit-8 assay and the percentage of apoptotic cells detected by annexinV-FITC/PI double-staining was determined by flow cytometry.Results:①The 14-3-3γ gene eukaryotic expression vector was successfully constructed and identified by sequencing. ②The expression level of 14-3-3γ protein was increased obviously after transfection (P<0.05). ③The inhibitory effect on the rate of cell proliferation was 52.90% after transfection (P<0.05). ④After transfection, the percentage of apoptotic cells was increased obviously (P<0.05).Conclusion:The 14-3-3γ-pCMV-N-Flag gene eukaryotic expression plasmid vector is successfully constructed which could suppress proliferation and induce apoptosis of uterine leiomyoma cells.

uterine leiomyoma; vector construction; proliferation; apoptosis

R711.74

A

1000-2138（2014）02-0079-04

2013-10-10

國家自然科學基金資助項目（811 7192 6）。

沈奇（1987-），男，浙江麗水人，博士生。

朱雪瓊，教授，主任醫師，博士生導師，Ema il：zjwzzxq@163.com。