快速DNA提取環介導等溫擴增技術檢測結核分枝桿菌的成本分析

歐喜超 夏輝 李強 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 章建康 池俊英 趙雁林

結核病的早期診斷，對于很好地控制結核病的傳播具有十分重要的意義。固體培養具有很高的診斷價值，但耗時較長，至少需要6～8周的時間。近年來涌現出很多新的技術和方法用于結核分枝桿菌的快速診斷及鑒定[1-2]。然而除了檢測效能，檢測成本也是制約各種技術或方法能否推廣的決定性因素之一。結核分枝桿菌快速DNA提取環介導等溫擴增檢測技術(procedure for ultra rapid extraction of loop-mediated isothermal amplification, PURE-LAMP；Eiken Chemical，日本)是一種基于分子生物學原理的快速檢測試劑盒，整個試劑盒采用封閉的反應體系，在反應體系內加入2條內引物和2條外引物，67 ℃等溫擴增40 min，然后通過紫外線照射觀察熒光強度進行結果判斷[3]。國內外的相關研究表明，PURE-LAMP檢測操作簡單、檢測準確性高，非常適合在實驗室條件不足或技術力量薄弱的結核病高負擔地區應用[4]。目前尚缺乏關于PURE-LAMP檢測成本的相關報道，本研究通過對比傳統固體培養法和PURE-LAMP檢測的成本，從成本角度出發，評估PURE-LAMP檢測在我國縣(區)級實驗室應用的可行性。

材料和方法

一、研究資料的來源

選取項目指定的河南省新鄉市結核病防治(簡稱“結防”)所、獲嘉縣CDC以及河南省CDC作為研究現場。2011年3月至2012年2月，新鄉市結防所和獲嘉縣CDC共連續納入1378例臨床初診肺結核可疑患者，新鄉市923例，獲嘉縣455例。實驗室對每份納入患者痰標本同時進行固體培養和PURE-LAMP檢測，培養陽性的菌株4 ℃冰箱保存，每月送至河南省CDC完成對硝基苯甲酸(PNB)菌群鑒定。為保證鑒定結果的準確性，每批固體培養陽性菌株在鑒定前需要進行傳代復蘇。

二、研究方法

每例納入患者留取3份痰標本(即時痰、夜間痰和晨痰)，實驗室工作人員對晨痰和夜間痰進行固體培養試驗和PURE-LAMP檢測，培養陽性菌株送至河南省CDC，對每例患者選取生長狀態最好的1管陽性菌株進行傳代培養和菌群鑒定試驗。

1. 結核分枝桿菌的傳統固體培養：遵照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[5]中的標準化操作程序，將每份處理后痰標本接種到2支商品化固體改良羅氏培養管中，培養基購自珠海貝索生物技術有限公司。

2. 菌群鑒定：采取PNB法進行菌群鑒定，具體操作參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]中的標準化操作程序執行。接種后3 d 觀察結果，以后每周觀察1次，直至孵育4周，同時記錄PNB培養基和中性改良羅氏培養基上菌落生長情況。在PNB培養基上未見菌落生長即為結核分枝桿菌復合群感染，生長則為非結核分枝桿菌感染。

3. PURE-LAMP檢測：使用PURE-LAMP法熒光檢測試劑盒，按照日本榮研化學公司提供的標準化操作手冊進行操作[7]。

4.“要素法”成本分析：收集檢測整個過程(從實驗室接收標本到報告結果和廢棄物處理等)所有直接和間接成本[8]，涉及以下幾方面要素：(1)管理費：維持實驗室正常運轉的基本費用，如水、電、辦公費、清潔、廢棄物和垃圾處理、安保等；(2)建筑費：實驗室建筑、改造及維修費用；(3)設備費：儀器設備的購買、維修、維護費用；(4)人員費：從事檢測相關人員工資、福利、津貼費用；(5)試劑費：檢測相關試劑費用；(6)耗材費：耗材及個人防護相關費用。

為了有效核算相關成本，需要針對實驗室檢測的所有步驟和程序分別收集相關數據，進行評估。固體培養試驗包括試劑準備、標本收集登記、培養操作、培養結果觀察登記和廢棄物處理等步驟。PNB菌群鑒定試驗包括試驗試劑耗材準備、鑒定試驗操作、結果觀察登記、廢棄物處理等步驟；PURE-LAMP試驗包括試劑準備、前處理及核酸擴增檢測幾個過程。

實驗人員按照要求在3個不同工作日，分別記錄3次高、中和低不同工作量情況下傳統固體培養、PURE-LAMP檢測和PNB菌群鑒定試驗全過程中的資源使用情況，各要素的成本以試驗過程中使用的各要素的數量乘以各要素的單位價格。其中資本性費用如實驗室空間、建筑物和設備等，其單位價格根據其采購價格和預計的使用年限按照年度折算；管理費用的計算是根據實驗室工作人員數量、人員工作時間和其他與該系統相關的基礎設施、建筑物的使用狀況，將相關費用分配到各次檢測中。PURE-LAMP檢測試劑的價格采用項目采購價格106元計算，固體培養和菌群鑒定相關耗材的價格采用目前市場采購價格。

結 果

一、每份痰標本固體培養和PURE-LAMP檢測成本分析

固體培養和PURE-LAMP檢測的單位檢測平均成本分別為51.10和120.90元，均以試劑費和耗材費所占比例較高，新鄉市固體培養檢測成本略高于獲嘉縣，主要是由于新鄉市的管理成本、人員費和耗材費用較高，新鄉市和獲嘉縣PURE-LAMP檢測平均建筑費分別為0.0042和0.0027元(表1)。

二、每例菌株傳代和菌群鑒定試驗成本分析

菌株傳代和PNB菌群鑒定的單位檢測成本分別為21.37和56.68元(表2)。

三、每例患者傳統方法檢測和PURE-LAMP檢測成本分析

傳統方法檢測每例患者是否感染結核分枝桿菌(2份培養，1份傳代，1份PNB鑒定試驗)需要180.25元，PURE-LAMP檢測每例患者是否感染結核分枝桿菌需要120.90元，比傳統方法低59.35元。

四、不同檢測準確度及患病流行率不同時， PURE-LAMP檢出每例結核病患者的成本

計算在不同結核病患病流行率的可疑人群中，與固體培養試驗相比，不同敏感度和特異度的PURE-LAMP檢出1例結核病患者的平均成本，平均成本=PURE-LAMP檢測成本/[(1-流行率)×(1-特異度)+流行率×敏感度)]。可疑人群中結核病流行率越高，應用固體培養和PURE-LAMP檢測檢出1例結核病患者的單位成本越低。當PURE-LAMP檢測特異度為95%時，只要敏感度高于60%，在結核病患病率低于50%的人群中，PURE-LAMP檢出1例結核病患者的平均成本均低于傳統方法(固體培養和PNB菌群鑒定試驗)(圖1)。

五、PURE-LAMP檢測設備和試劑耗材價格變化時對單位檢測成本的影響

由于PURE-LAMP檢測設備和試劑價格在整個成本中占有較大比重，并且對于將來市場推廣具有一定影響，因此在項目使用的設備及試劑價格基礎上，調整了50%、80%、100%、120%、150%和200%，分析價格變化對檢測成本的影響。結果顯示，當LAMP檢測設備價格分別調整為現有價格的50%時，單位檢測成本僅下降了0.17元，而當設備價格為現價格的200%時，單位檢測成本較現有價格僅上升了0.38元，設備價格的變化對單位檢測的成本影響不大；但是，當調整檢測試劑為現價格的200%時，單位檢測成本將增加108.86元，達到229.76元，單位檢測成本隨試劑價格的變化幅度比較大。

討 論

本研究采用“要素法”成本分析比較了在我國縣(區)級結核病實驗室固體培養和PURE-LAMP檢測分別用于結核病診斷的成本。整個研究從衛生服務的角度出發，分析與固體培養和PURE-LAMP檢測相關的直接和間接的貨幣成本。研究發現固體培養管理費、建筑費和耗材費均顯著高于PURE-LAMP檢測，但是PURE-LAMP檢測設備和試劑價格較高，導致PURE-LAMP檢測單位成本費用高于固體培養。目前，我國縣(區)級實驗室不具備開展菌群鑒定和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的能力，固體培養陽性菌株需要送到省參比實驗室完成菌群鑒定，導致檢測時間和檢測成本均顯著增加。之前有研究表明，取患者1份痰標本進行PURE-LAMP檢測即可達到很好的檢測效能[7]。因此，本研究中每例患者PURE-LAMP檢測成本按照1份痰標本檢測進行計算。綜合考慮每例結核病患者的實際診斷情況，PURE-LAMP檢測成本低于固體培養。

一、固體培養和PURE-LAMP檢測成本影響因素分析

通過此次研究，筆者發現諸多因素可能會影響到固體培養和PURE-LAMP檢測的成本。首先，PURE-LAMP檢測的診斷周期為2 h，而固體培養需要4～8周，這將導致固體培養與時間相關的成本包括管理費、人員費、儀器費等成本顯著上升；其次，兩個實驗室不同檢測成本也呈現出地域差異，其中新鄉市工作人員工資水平更高，這使得新鄉市的人員成本顯著高于獲嘉縣。此外，兩個項目點管理費用差別也較大，實驗所用耗材為當地自行采購，因此，在耗材方面兩個實驗室之間也表現出一定的差異。

表1 不同地區每份痰標本固體培養和PURE-LAMP檢測的單位檢測成本(人民幣：元)

表2 河南省CDC進行傳代和PNB菌群鑒定的單位檢測成本(人民幣：元)

Se：敏感度；Sp：特異度

二、固體培養和PURE-LAMP檢測成本效益比較

除了更低的價格，PURE-LAMP檢測比傳統固體培養還有諸多優勢。首先，PURE-LAMP檢測用時更短。其次，PURE-LAMP檢測采用封閉的反應體系，擴增產物無需開蓋通過肉眼觀察就可判讀結果，降低了污染發生的可能性。其三，PURE-LAMP檢測更符合生物安全要求；PURE-LAMP檢測是一種基于核酸檢測的方法，因此其安全性優于傳統的涂片鏡檢和固體培養。綜合考慮其成本和這些相關因素，PURE-LAMP檢測是一種更符合成本-效益的結核分枝桿菌檢測方法。

三、研究局限性

本研究中存在幾個明顯的不足。首先，本研究雖然分析了兩種檢測方法的成本，但由于后期效益(包括患者發現后治療及傳播風險等因素)沒有加以考慮，因此本研究進行的成本-效益分析不夠全面；其次，在分析單個結核病患者的發現費用時，僅從成本角度考慮，但在實際臨床檢測中，當敏感度低于50%的檢測方法無實際使用價值。因此，后續深入研究將圍繞如何建立模型評估快速診斷的社會經濟效益等方面展開。

總之，本研究表明在目前現有情況下，PURE-LAMP檢測是一種比傳統固體培養試驗更經濟更快速的結核分枝桿菌檢測方法。如果生產廠商在未來能夠降低市場價格并優化產品性能，將更有利于PURE-LAMP檢測在縣(區)級結核病診斷實驗室的推廣。

志謝河南省CDC、新鄉市結防所和獲嘉縣CDC工作人員在數據收集過程中給予了支持和配合。美國帕斯適宜衛生科技組織在數據分析和撰寫過程中給予了幫助。Hojoon Sohn在方案設計中給予了大力幫助

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