結核感染T細胞酶聯免疫斑點試驗與結核抗體檢測在骨關節結核輔助診斷中的價值

范俊 秦世炳 賈紅彥 潘麗萍 蘭汀隆

骨關節結核是肺外結核中最常見的慢性疾病[1]，常常隱匿起病，早期臨床癥狀多不典型，早期診斷與鑒別診斷困難，易被延誤治療。而骨關節結核的早期診斷至關重要，及時的早期治療可以減少軀體殘疾和損傷的發生率[2]。目前，骨關節結核實驗室診斷主要依靠結核分枝桿菌培養，但陽性率較低且耗時長，組織病理學診斷標本不易獲得而且為有創性，從而使得骨關節結核的早期診斷面臨巨大的挑戰，因此迫切需要尋找一種新的輔助診斷方法以提高骨關節結核的早期快速診斷水平。結核抗體的檢測已被廣泛應用于血清及體液標本的檢測，但敏感度和特異度并不理想[3]。近年來，酶聯免疫斑點(ELISPOT)技術逐漸興起，結核感染T細胞酶聯免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)即為其代表[4]。本研究初步探討T-SPOT.TB和結核抗體檢測在早期骨關節結核中輔助診斷的意義與價值。

資料和方法

一、 一般資料

選取2011年7月至2013年10月期間，在北京胸科醫院收治的骨關節疾病患者432例，其中男250例，女182例；年齡15～77歲，平均(48±16.7)歲。排除其中診斷不明確的患者39例、無病理學或細菌學證據的患者40例和未完成全部檢測的患者128例，共納入225例患者。所有患者HIV檢測均為陰性，均無免疫抑制劑及免疫增強劑使用史。將入選的225例患者分為結核組和對照組，均經T-SPOT.TB試驗檢測及血清學結核分枝桿菌特異性IgG抗體檢測。本研究經首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會審核并通過[批件號：(2011)年KY臨審第(13)號]，征得受試對象同意并簽署知情同意書。

1.結核組入選標準：選擇初治的骨關節結核患者，所有患者抗結核治療均<1周，均行手術治療，術后留取膿液送抗酸染色涂片鏡檢及結核分枝桿菌培養陽性，并由組織病理學確認結核病診斷。排除標準：術后結核分枝桿菌培養及組織病理不能確認診斷者；合并其他部位結核患者。符合入選標準的患者146例，排除標準排除54例，排除原因為合并肺結核、淋巴結結核等其他部位結核。最終入組92例，其中男53例，女39例，年齡15～76歲，平均(40.0±15.4)歲。以病理診斷或改良羅氏培養為金標準[5]，其中脊柱結核65例，髖關節結核8例，膝關節結核6例，肘關節結核5例，肩關節結核5例，腕關節結核2例，胸鎖關節結核1例。

2.對照組入選標準：所有患者均行手術治療，并由病理明確診斷。結核分枝桿菌培養及組織病理學均排除結核診斷，無其他部位結核和結核病接觸史。排除標準：術后病理診斷不清楚及不能完成隨診。非結核骨關節疾病患者79例，按排除標準排除15例，排除原因為不能完成隨診。最終入組共64例，其中男35例，女29例，年齡16～77歲，平均年齡(43.3±17.8)歲。對照組患者包括脊柱腫瘤35例，強直性脊柱炎5例，化膿性關節炎6例，腰椎退行性病變12例，骨折患者6例。

兩組患者的年齡經配對t檢驗(t=-1.117，P=0.266)，性別經卡方檢驗(χ2=0.131，P=0.717)，差異均無統計學意義。

二、 方法

1. T-SPOT.TB試驗操作方法：采用 T-SPOT.TB檢測試劑盒(英國Oxford Immunotech公司提供)并嚴格按照試劑盒說明書要求進行檢測。骨關節結核患者均于住院次日凌晨空腹抽靜脈血5 ml，肝素抗凝，用標準的Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法分離得到外周血單個核細胞(PBMCs)，以自動細胞計數儀計數并調制成濃度為2.0×106/ml的細胞懸液。以細胞培養液作為陰性對照，植物血凝素(PHA)作為陽性對照，結核分枝桿菌特異性抗原早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)和培養濾液蛋白-10(CFP-10)作為刺激抗原。4個孔內分別加入含250 000 個PBMCs細胞的細胞懸液，將微孔板放在含有5%CO2的培養箱中培養18～20 h。洗板后加入生物素標記的二抗，2 ℃～8 ℃反應1 h，洗板后加入顯色底物液，室溫靜置7 min后終止反應。觀察結果，通過酶聯免疫斑點系統(CTL-ImmunoSpot?S5 Versa Analyzer)記錄斑點數。結果判定標準：當空白對照孔內斑點數<6個時，任一實驗孔斑點數減去空白孔斑點數≥6個，結果即為陽性；若空白對照孔斑點數≥6個，任一實驗孔斑點數≥2倍空白孔斑點數，結果為陽性；若空白對照孔內斑點數≥10個或陽性對照孔內斑點數<20個，試驗無效。

2.結核抗體檢測：所有患者均行血清學結核分枝桿菌特異性IgG抗體檢測。結核分枝桿菌抗體免疫印跡法試劑盒由北京宜安泰醫療技術開發有限公司提供，按試劑盒說明書進行檢測及結果判定。

三、統計學方法

采用SPSS 17.0進行統計學分析。預測值和似然比按下列公式計算：陽性預測值=真陽性例數/總陽性例數，陰性預測值=真陰性例數/總陰性例數，陽性似然比=真陽性率/假陽性率，陰性似然比=假陰性率/真陰性率。T-SPOT.TB試驗檢測數據與結核抗體檢測數據之間的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

骨關節結核患者，以組織病理學及羅氏培養陽性至少其中一項為金標準，T-SPOT.TB方法敏感度和特異度分別為93.5%(86/92)和78.1%(50/64)；結核抗體檢測的敏感度和特異度分別為64.1%(59/92)和81.3%(52/64)。T-SPOT.TB方法在92例骨關節結核患者中86例陽性，結核抗體檢測59例陽性，92例骨關節結核患者兩者的重疊率為60.9%(56/92)，抗結核抗體檢測陽性而T-SPOT.TB檢測陰性者2例；T-SPOT.TB檢測陽性而抗結核抗體檢測陰性者27例；兩者均陰性2例。兩組方法的比較采用χ2檢驗，兩種檢測方法特異度相近，但T-SPOT.TB方法陽性檢出率高于抗結核抗體檢測方法，差異有統計學意義(χ2=23.72，P<0.01)(表1)。

表1 T-SPOT.TB試驗與結核抗體檢測對骨關節結核病的診斷價值

討 論

1.抗結核抗體對診斷骨關節結核的現狀：對于骨關節結核的診斷，尤其早期骨關節滑膜結核的診斷，由于難于取材供細菌學和組織學檢查，血清及各種體液特異度抗體的檢查就變得非常需要。本實驗中檢測血清標本中結核抗體IgG的原理是通過對包括結核分枝桿菌在內的13種分枝桿菌菌體多肽抗原成分及結核病患者血清中結核分枝桿菌特異性抗體譜的分析,純化出結核分枝桿菌H37Rv株菌體特異性多肽抗原成分，相對分子質量介于34 000～43 000 的蛋白質抗原)，從而檢測血清標本中結核分枝桿菌抗原的抗體[6]。本研究中進行結核抗體檢測的92例骨關節結核患者中，59例陽性，敏感度僅為64.1%，這可能與不同個體的免疫狀態有關；或患者正處于臨床感染的窗口期，可表現為抗體檢測陰性。本檢測的特異度81.3%，考慮原因如下：決定結核分枝桿菌抗體檢測特異度的關鍵在于抗原的選擇，目前重要的結核分枝桿菌感染血清檢測抗原大多同時存在于非結核分枝桿菌和卡介苗(BCG)中，本實驗中結核分枝桿菌抗體檢測試劑是經過Mtb與BCG蛋白組學電泳對比純化出的BCG缺失蛋白成分，應具有較好的特異性，但是電泳分離不可避免微量BCG共有蛋白的污染[7]，造成假陽性的增高。

2.T-SPOT.TB檢測技術在骨關節結核診斷中應用：近來，T-SPOT.TB檢測技術利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術的基本原理在單細胞水平檢測分泌γ干擾素(INF-γ)的T淋巴細胞，已經成為一種新的結核分枝桿菌感染的快速診斷工具。通過結核分枝桿菌RD1區基因編碼產生的ESAT-6和CFP-10來刺激機體T淋巴細胞，產生特異細胞因子γ干擾素來診斷是否存在結核分枝桿菌感染[8]。這2種蛋白為結核分枝桿菌特異性抗原，其編碼基因在BCG和絕大多數非結核分枝桿菌的基因編碼區是不存在的，因而從根本上避免了傳統結核菌素皮膚試驗中所存在的BCG交叉抗原反應，從而確保T-SPOT.TB具有較高的特異度。同時T-SPOT.TB檢測技術自身的敏感度也較高，每100萬個外周血單個核細胞中即可檢測到一個特異性T淋巴細胞，對于肺外結核的診斷，T-SPOT.TB具有較高的敏感度。本研究應用T-SPOT.TB方法檢測的92例骨關節結核患者中，86例T-SPOT.TB檢測結果陽性，其敏感度為93.5%，此結果與Kim等[9]的研究結果一致。T-SPOT.TB的敏感度顯著高于結核抗體檢測技術(P<0.05)，因此T-SPOT.TB方法在骨關節結核的早期診斷中具有更重要的輔助診斷價值。

3.T-SPOT.TB檢測技術的局限：本研究中，在64例非結核性骨關節疾病患者中，12例(18.8%)T-SPOT.TB結果陽性，導致本研究的特異度偏低。這主要是由于中國屬于結核病高發病區，2010年統計的活動性肺結核患病率為459/10萬[10]，發病率位居世界第二，結核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者占總人口的44.5%[11]。T-SPOT.TB檢測技術不能區分LTBI和活動性結核病[12-13]，其特異度受該地區LTBI流行情況影響，即使沒有明確的結核病暴露史也有可能已存在LTBI，LTBI的高流行背景可能導致了T-SPOT.TB試驗的低特異度。所以不能僅憑借T-SPOT.TB 試驗陽性結果就診斷活動性結核病，仍需結合患者的臨床病史、放射學診斷以及其他診斷方法做出綜合的判斷。

綜上所述，在臨床上疑似骨關節結核患者，在缺乏病原學依據的時侯，T-SPOT.TB試驗作為一種非侵入性且便利的輔助診斷方法，其陽性結果能給臨床醫生提供更多診斷骨關節結核的有用信息。為了更為準確判斷T-SPOT.TB試驗在我國這種結核病高流行國家的骨關節結核病的輔助診斷價值，在以后的研究中還需要擴大樣本量，并進行前瞻性研究，尤其是其特異度可能受LTBI的影響，有待進一步研究。

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