基于莖環引物定量檢測miRNA的研究進展

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(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

miRNA是一類廣泛存在于生物體內的非編碼RNA,長度約為22nt。自1993年Lee等人[1]首先發現lin - 4基因表達的一種小RNA(lin - 4 RNA)以來,至今已報道的miRNA達到上萬種。研究表明,miRNA在生物體內發揮著重要調節作用,如動物的神經系統發育和變態發育等生理過程與一些miRNA的表達有關[2 - 4]。另外,在疾病治療,特別是癌癥治療中,miRNA作為標記物或基因藥物也發揮了重要作用[5 - 7]。近期Zhang等人[8]以小鼠作為研究對象,對經口服攝入的植物miRNA的功能進行研究,驚喜的發現大米中的miRNA可以通過攝食在小鼠體內穩定存在,并發揮生理調節功能,miRNA因此被稱作攝入的“信息”而再次引起關注。

隨著生物信息學的發展,一些靶基因預測軟件如TargetScan[9]、PicTar[10]、miRanda[11]和DIAN -microT[12]等,實現了對大量新的miRNA的預測[13]。然而,如需驗證新預測的miRNA或研究已知miRNA表達量與功能間的關系,必須對其建立高效準確的定量方法。RNA印跡雜交法(Lee等[14])和基因芯片(Sun等[15])是研究miRNA表達的主要傳統方法,但樣品需求量大、線性范圍和靈敏度有限(見表1)的突出缺陷限制了其應用。隨著實時定量PCR(real time- quantitative PCR,RT - qPCR)技術的出現,推動了核酸定量的革命性進步,該法已廣泛用于食品中微生物、致病菌的檢測與定量和農業中植物致病菌檢測等生物技術領域[16 - 17]。miRNA的檢測也因此獲益,依托該技術建立的miRNA測定方法應運而生。表1列舉了現有的幾種miRNA常用定量方法,比較顯示,RT - qPCR具備更簡便、快速、定量濃度范圍廣,以及特異性高等諸多優勢。

表1 miRNA定量方法比較[18]Table 1 Comparison of miRNA quantification methods[18]

由于miRNA只有22nt左右的長度,反轉錄后不能直接應用RT - qPCR對其進行擴增。2005年,Chen等人[19]發明了基于莖環引物的miRNA定量方法,在PCR前有效的對其進行了長度的延長,使RT - qPCR技術真正應用到了miRNA的定量檢測中。經過不斷改進,該方法發展迅速,已經成為目前在生物、醫藥、食品等領域定量miRNA最為重要的技術手段。本文將系統介紹該技術自建立近十年來在引物設計、多重定量、熒光標記等方面的發展及其應用情況,對之原理及關鍵技術進行綜述,以期對miRNA的定量檢測的應用和發展有所幫助。

1 基于莖環引物的RT - qPCR法定量單一miRNA

RT - qPCR是基于莖環引物的miRNA定量檢測中使用的核心技術,它是在普通PCR技術基礎上發展起來的一種核酸定量技術,由美國PE公司于1995年推出,Heid等人[20]首先對之原理和方法進行了報道。它實現了核酸PCR由定性到定量的跨越,引起了研究人員的廣泛關注。

RT - qPCR的關鍵是在PCR反應體系里添加可以產生熒光信號的分子,通過實時測定體系熒光信號監測目的片段的PCR反應進程。熒光域值(threshold)和循環域值(Ct)是RT - qPCR中的兩個重要參數[21]。熒光域值,也稱本底信號,一般默認設置為反應3 ～ 15循環后熒光信號的標準偏差的十倍以上,信號在達到此域值前被背景信號掩蓋。Ct值是每個反應體系的熒光信號達到熒光域值所對應的循環數。Ct值與體系內起始模板拷貝數的對數一般成線性相關,據此可得到標準曲線,以實現對未知樣品起始模板數的定量。根據體系中熒光標記原理不同,RT - qPCR分為探針類和染料類。在定量miRNA的過程中主要應用Taqman探針法和SYBR Green I法。

使用RT - qPCR技術定量miRNA的瓶頸問題是其長度較短,無法實現直接PCR擴增,因此世界各國的科學家提出了多種長度延伸的方案,如基于poly A聚合酶加尾法[22]、LNA技術的引物延伸法[23]、基于莖環引物(Stem - loop Primer)的RT - qPCR法(SLP - RT- qPCR)等。其中基于莖環(Stem - loop)引物的RT -qPCR法在定量miRNA過程中具有特異性強、靈敏度高、miRNA前體的背景干擾小、線性范圍廣、效率高等優點。后經過科研人員的不斷改進,在目前miRNA和siRNA等類似小RNA的研究中頗受青睞[24 - 28]。

1. 1 SLP - RT - qPCR對單一miRNA定量原理

圖1描述了SLP - RT - qPCR技術的操作原理,分為逆轉錄和qPCR兩個過程。如圖所示,依據靶標miRNA特別設計的莖環引物3′ - 端有6 ～ 8nt堿基與靶miRNA 3′ - 端互補,通過其與miRNA的特異性互補結合挑選模板,作為引物進行反轉錄。即miRNA與特異性莖環引物結合后逆轉錄產生cDNA,作為下一步PCR擴增的模板。在PCR擴增中使用特異性上游引物和與莖環部位相對應的通用下游引物進行擴增。特異性上游引物的一部分與miRNA具有相同的序列。依據不同發光原理,特異性熒光探針或通用熒光染料在cDNA擴增過程中產生熒光信號,通過監測信號達到定量或半定量的目的。

圖1 基于莖環引物的RT - qPCR原理Fig. 1 The principle of RT - qPCR based on Stem - loop primer

在整個定量過程中,高效、特異性地將目的miRNA全部逆轉錄是后續成功定量的前提,莖環引物解決了短鏈模板不能PCR擴增的難題,并保證了高靈敏性,是之后RT - qPCR應用的關鍵。

1. 2 莖環引物(Stem - loop Primer)

成熟miRNA的長度僅為22nt左右,普通的線性PCR引物由于長度的限制,無法用于miRNA擴增。莖環引物的出現,有效地彌補了普通引物的缺陷。針對miRNA設計的莖環引物持有莖 - 環狀結構,保證了特異性的同時延長了miRNA逆轉錄cDNA產物的長度,以利于其擴增。Chen等人[19]設計的莖環引物(5′ - GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA TTCGCACTGGATACGAC - 3')構造如圖2所示,其總長度在50nt左右,由一段與miRNA特異性互補序列和一段較長的通用序列組成。

莖環引物3′ - 端有一段與miRNA特異性互補的堿基序列(一般為6 ～ 8nt),這是區別相似miRNA,保證特異性的第一步,PCR過程中特異性上游引物是保證擴增特異性的第二步。圖2中兩段莖柄區序列堿基互補,形成莖環的柄部。柄部的堿基堆積使miRNA的穩定性增加,提高了逆轉錄效率。其雙鏈結構和自身互補形成莖環構象,可避免逆轉錄引物與miRNA前體及同源RNA發生雜交,減少背景干擾,若結合TaqMan探針可達到區分單個堿基差異的效果[19]。莖環引物的環中還包括了一段PCR過程中的通用下游引物序列(5′ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3′),它和上游引物一起完成PCR擴增。在莖環引物的序列中還特別插入較多G/C堿基,提高其退火溫度,減少PCR非特異性擴增。

圖2 莖環引物構造Fig. 2 The structure of Stem-loop Primer

在Chen等人設計的序列基礎上,為設計通用探針,使該法操作更加簡單,Mohammadi等人[29]對上述序列進行了優化,設計新序列(5′ - GGTC GTATGCAAAGCAGGGTCCGAGGTATCCATCGCACGC ATCGCACTGCATACGACC - 3′),將長度延伸14nt,使環部增長并提高了莖部退火溫度,設計通用TaqMan探針,省去實驗過程中分別為每種miRNA設計特異探針的步驟,節省時間降低實驗成本。經驗證,該序列在miRNA檢測中可以保證良好的特異性與靈敏度,對部分miRNA的檢測限可達每微升6個拷貝。

2 基于莖環引物的多重RT - qPCR法同時定量多種miRNA

越來越多的研究表明,miRNA的種類數量非常龐大。Bentwich等[30]通過生物信息學預測分析和基因芯片驗證等方法發現,僅人體miRNA的數量就超過800種。基因芯片是在一個反應中同時分析多個miRNA的常用方法,但就目前的技術水平它對RNA的用量要求很高(一般超過1μg),然而一般提取方法從少量樣品(如癌細胞等)中得到的RNA量無法滿足這種需求。為使RT - qPCR法實現同時定量多種miRNA,同時降低對樣品RNA需求的目的,Tang等人[31]應用基于莖環引物的RT - qPCR方法對單個胚胎干細胞中220種miRNA表達進行同時檢測,成功實現了多重定量。Lao等人[32]對Tang等的方法進行了進一步驗證,并對小量樣品中的多種miRNA同時進行檢測,證實了其可行性。

圖3展示了多重RT - PCR同時定量多種miRNA的過程。全過程主要包括兩大部分,即使用不同莖環引物同時逆轉錄所有目的miRNA和特異性定量目標cDNA。細胞裂解得到的總miRNA在同一體系內同時進行逆轉錄(根據需要測定的miRNA種類分別設計莖環引物),逆轉錄得到的全部cDNA用特異的上游引物(根據需要檢測的目的miRNA分別進行設計)和通用下游引物同時進行一次預擴增反應,最后分別針對目的miRNA反轉錄的cDNA產物加入相應的熒光探針或染料單獨進行定量PCR反應。

圖3 多重RT - qPCR定量多種microRNA過程Fig. 3 Multiplexing RT - qPCR for the detection of multiple microRNAs

相較于單重定量反應,多重定量過程中采用循環脈沖逆轉錄反應并增加預擴增過程,以保證逆轉錄效率且提高檢測的靈敏度[31]。

2. 1 循環脈沖逆轉錄反應

一般條件下,逆轉錄反應要在逆轉錄酶最適溫度下孵育半小時,來保證逆轉錄效果。在多重反應體系中,體系復雜,不同引物間和不同miRNA間發生非特異性結合的概率大,且逆轉錄效率也較單重反應低。Tang等人[31]設計引入的循環脈沖溫育(20℃,30s;42℃,30s;50℃,1s;60個循環),增加了逆轉錄效率,并且減少引物間和不同miRNA間的非特異性擴增。相較于普通逆轉錄,它將各產物的Ct值降低1左右,提高了檢測的靈敏度。逆轉錄莖環引物濃度降低為單重反應的2% ～ 10%,進一步減少了引物間的非特異性結合。

2. 2 預擴增反應

在多重定量反應中,預擴增是非常重要的一步。為提高檢測的靈敏度,在進行定量之前,需將所有cDNA進行PCR,使各cDNA得到同數量的擴增,為后續定量提供更多模板。為驗證所有的cDNA是否都以相對統一的效率擴增,Lao等人[32]將逆轉錄整體cDNA產物分別進行1、5、10、14個循環的預擴增后分別對48種和190種miRNA分別進行定量,Ct值結果顯示,適當預擴增未產生明顯偏差,各cDNA相對擴增效率相同。Mestdagh等人[33]對上述結果進行了進一步驗證,預擴增大大提高了檢測的靈敏度,降低了檢測所需要的RNA數量,且未偏離含量的真實水平。預擴增循環數控制在14以內為宜,當循環數過高時,不同miRNA的cDNA擴增效率產生的偏差增大,模板數擴增量不同,產生的PCR模板不能真實反映樣品中miRNA含量情況。

3 SLP - RT - qPCR定量miRNA的應用

目前針對miRNA相關研究正在不斷深入,其在多種疾病,特別是癌癥的診斷與治療方面發揮了多種功能。癌癥等重大疾病的發作往往伴隨著miRNA表達量的改變,使之可作為疾病標記物或診斷依據。SLP - RT - qPCR作為一種理想的miRNA定量方法,既可以對單一miRNA進行定量也可以實現多重定量,在定量癌細胞等動物樣本miRNA表達量的研究中廣泛應用。除了病理過程,miRNA還參與了生物體內其他多種生理過程,如變態發育、組織分化等。它們在這些過程中的作用大小與其表達量直接相關,SLP - RT - qPCR多與高通量測序等技術結合使用,系統研究miRNA表達情況。

Xu等人[34]用SLP - RT - qPCR對52名結腸直腸癌患者的癌細胞組織中miR - 21,miR - 31等四種miRNA表達進行了定量檢測發現,與正常組織相比,腫瘤細胞內這四種miRNA表達量明顯增加。Li等人[35]用同樣方法對38個乳腺癌樣本和正常樣本中miR - 26b表達量定量檢測發現,乳腺癌樣本中該miRNA表達量明顯降低,進一步的研究發現miR -26b有可能通過調節相關蛋白抑制乳腺癌細胞生長,為乳腺癌治療提供幫助。Luo等人[36]對喉鱗狀細胞癌中miR - 139表達量定量檢測結合相關蛋白質表達研究發現,miR - 139可以抑制CXCR4表達,進而起到抑制癌細胞擴散和轉移的作用。

除了直接定量相關miRNA表達量,由于SLP -RT - qPCR法準確、靈敏的檢測能力,常被用于驗證高通量測序得到的miRNA表達譜結果。Wei等人[37]采用深度測序技術系統地建立了催乳素治療或未被治療的乳腺癌T - 47D細胞的miRNA表達譜,并選取4種已知miRNA采用SLP - RT - qPCR法定量檢測,驗證了測序結果的可靠性。

4 SLP - RT - qPCR定量miRNA的發展

SLP - RT - qPCR技術雖然僅僅發明了十年時間,但是已經經歷了大量的革新和進步。其發展主要體現在莖環引物的設計、多重定量方法的建立以及RT - qPCR技術中使用的新型探針/染料的研發等方面。前兩個方面已有提及和論述,這里我們重點介紹一下用于定量的探針/染料的發展。多種新熒光標記的出現及應用,使該技術的結果呈現方式更加靈活,其中UPL(Universal Probe Library)通用探針和SYBR Green I等更加快捷、低成本的熒光指示物替代TaqMan探針,降低了定量檢測成本且實驗操作更加簡便。

4. 1 UPL探針

早期RT - qPCR使用的主要是TaqMan探針,它是一種長20nt左右的寡核苷酸序列,其5′ - 端連有一個熒光報告基團,3′ - 端有一個熒光淬滅基團,探針完整時報告基團熒光被淬滅,不會產生信號。它通過堿基配對與產物結合,利用Taq聚合酶的外切酶活性,探針在擴增過程中被切斷,報告基團因與淬滅基團遠離而產生熒光信號。特異性TaqMan探針為檢測提供了高特異性,但每種探針的設計和優化大大提高了檢測成本。

基于TaqMan探針的缺點,羅氏公司推出了UPL通用探針[38],長度僅為8 ～ 9個堿基,結合LNA技術合成。此類探針的最大優勢即省去了為每種miRNA單獨設計探針的過程,特別是為定量多種miRNA節省大量時間。LNA是一種核酸修飾技術,通過一個亞甲基橋將核糖的2′ - 位氧原子和4′ - 位碳原子連接起來(如圖4所示),增加了核酸的穩定性,提高了熔點溫度。

圖4 LNA單體示意圖Fig. 4 LNA Monomer

這種探針雖然序列短,但由于LNA的加入而大幅度提高了熔點。通過配合莖環引物上特定序列使用,能保證很高的檢測特異性。Wu等人[39]使用UPL探針利用SLP - RT - qPCR法對植物中幾類miRNA檢測發現,UPL探針表現了良好的特異性和靈敏度。Stratford等人[40]用該法定量siRNA時,比較TaqMan探針和UPL探針的特異性發現,定量過程中的特異性主要由莖環引物提供,兩者未表現出明顯區別。利用UPL探針檢測miR - 166,經過45個循環反應,陰性對照未檢測到熒光信號[41]。

4. 2 SYBR Green I的應用

SYBR Green I是一種非飽和的菁類熒光素,可以與DNA雙鏈的小溝非特異性結合,在游離狀態時幾乎無熒光信號,結合后熒光信號增強[42]。反應體系中熒光信號強度代表了DNA雙鏈的數量。SYBR Green I具有通用性強、經濟低毒的特點,在miRNA以及DNA、mRNA等各種核酸物質的定量中都有廣泛應用。也正是由于其通用性強的特點,因而可以與體系內其他引物二聚體等雙鏈結合,使背景干擾增加,無法應用于多重定量中。

事實上,應用于miRNA定量的探針/染料的發展是隨著RT - qPCR的發展而同步進行的,這種發展為SLP - RT - qPCR的發展注入了新的活力。UPL探針與SYBR Green I染色應用,簡化了為每種miRNA單獨設計探針的過程,特別是UPL探針在多重定量中的應用,降低了檢測的成本,且提供了相當的特異性和靈敏度,這對該方法的應用推廣起到了促進作用。

5 結語

基于莖環引物的RT - qPCR方法特異性好、靈敏度高、效率高,是一種定量miRNA的理想方法,已經被廣泛應用與動物和植物miRNA的研究[30,43]。它簡化了實驗的操作步驟,無需電泳、染色等后續操作。高通量檢測的發展,讓該方法應用更加廣泛,在短時間內即可完成對多種miRNA的定量。鑒于多種優勢,該方法已經推廣到siRNA等類似的小RNA定量中,對RNA干擾的相關研究起到了很大的推動作用[22]。但遺憾的是迄今還沒有任何一種定量方法可以對任意miRNA保證相同的檢測效率。隨著對miRNA研究的深入,一些恒溫檢測技術如RCA[44]、環介導恒溫擴增[45]、基于DNA酶切的信號擴增[46]等相繼應用到RNA檢測,相信更加穩定高效的定量方法將會出現。

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