黑莓籽對四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠的影響

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(黃河科技學院,河南鄭州 450063)

黑莓(Rubusspp. Blackberry)屬于薔薇科(Rasaceae)懸鉤子屬聚合果類植物,其果實具有很高的營養價值和藥用價值,具有改善人體新陳代謝、清除自由基、延緩衰老和增強免疫力等功能,特別具有降低膽固醇含量、防治心臟疾病、抗癌(降低化療引起的毒副作用)和抗血栓的功效[1 - 6]。

研究表明,黑莓籽油含有較高的不飽和脂肪酸,如棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等[7],能夠提供給人體基本的脂肪酸,而且這些脂肪酸不能通過任何已知的化學途徑合成,必須從食物中獲取。另外,黑莓籽油具有清除自由基,抑制H2O2誘導的小鼠紅細胞氧化溶血,抑制VC- FeSO4體系誘導的小鼠肝組織丙二醛生成和小鼠肝線粒體腫脹等作用;黑莓籽油中富含各種抗氧化劑,與其抗心血管脂氧化和抗癌活性息息相關[8 - 9];此外,還發現黑莓籽經脫脂后的主要有效成分為原花青素,是由單體黃烷 - 3 - 醇以不同聚合度連接而成的多酚類化合物,具有高效的清除自由基的能力,具有治療動脈硬化、消炎防腫、抗突變和預防癌癥等廣泛用途[10 - 11]。

黑莓果汁、果酒等加工過程中會產生大量廢棄物黑莓籽。研究表明,黑莓籽殘留有豐富的脂肪酸、多酚等化合物。近年來,河南省封丘縣調整農業產業結構,大面積推廣種植該品種,通過對黑莓籽研究,既可對其進行有效的綜合利用,提高黑莓加工的綜合利用,又可變廢為寶,增加社會效益。本文采用尾靜脈注射四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠模型,首次研究黑莓籽對糖尿病小鼠血糖、脂質代謝和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

黑莓籽于2013年7月購買于河南省封丘縣,由河南大學生藥教研室李昌勤教授鑒定為薔薇科(Rasaceae)懸鉤子屬聚合果類植物植物黑莓(Rubusspp. Blackberry)籽,標本存于黃河科技學院天然藥物研究所。

健康昆明種小鼠120只,6 ～ 8周齡,體重(25±2)g,由河南省實驗動物中心提供。飼養條件:室溫控制在 25 ～ 27℃,自由采食和飲水,普通優質飼料喂養。

葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業有限公司;甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TCH)測定試劑盒 浙江東甌診斷產品有限公司;肝/肌糖元測定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、SOD試劑盒(測總) 南京建成生物工程研究所);阿卡波糖 杭州中美華成制藥有限公司;四氧嘧啶 Alfa Aesar。

UV - 2000型紫外可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司;Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo Electron公司;LRH - 150恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;電子天平 美國Mettler - Toledo公司;旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 黑莓籽浸膏的提取 黑莓籽粉采用浸出法,50L石油醚冷浸4次脫脂,每次3d,濃縮、回收石油醚得到黑莓籽油;殘渣揮干石油醚后,加入40L 70%乙醇冷浸3次,每次3d,濃縮、回收乙醇得到黑莓籽乙醇總浸膏。總浸膏分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取,得黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

1. 2. 2 四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠模型[12 - 13]健康昆明小鼠150只,隨機分為兩組,正常對照組10只,其余的為糖尿病造模組。糖尿病造模組于禁食不禁水12h后,尾靜脈注射80mg/kg四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠。正常喂養72h后,禁食不禁水12h,眼眶取血,測空腹血糖水平,依據血糖均衡原則將血糖水平在11. 1mmol/L以上的小鼠分成14組:糖尿病模型組,阿卡波糖陽性對照組,石油醚部位高、中、低劑量組,乙酸乙酯部位高、中、低劑量組,正丁醇部位高、中、低劑量組,油高、中、低劑量組。模型組和空白組灌胃0. 5%羥甲基纖維素鈉水溶液(CMC - Na),其它實驗組用0. 5%CMC - Na分別配制成相應濃度的溶液,灌胃給藥,1次/d,連續給藥7d,于末次給藥后2h眼眶取血測餐后血糖水平,并于當晚禁食不禁水12h,第8d摘取眼球取血,分離血清,放置于冰箱(0 ～ 3℃)保存,用于測定給藥后空腹血糖、TG、TCH、MDA和SOD。處死動物,取肝臟并稱重,并制備肝糖元測定液,用于測定肝糖元含量。

1. 2. 3 生理指標測定方法 血糖按上海榮盛生物藥業有限公司生產的試劑盒說明書操作;TG和TCH按浙江東甌診斷產品有限公司生產的試劑盒說明書操作;肝糖元、MDA和SOD均按南京建成生物工程研究所生產的試劑盒說明書操作。

2 結果與分析

2. 1 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠血糖的影響

由表1可以看出,給藥前,與空白組相比,糖尿病組(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、油、陽性對照和模型組)空腹血糖均呈顯著性升高(p<0. 05),說明四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠造模成功,并且各給藥組之間無顯著性差異(p>0. 05)。

給藥治療7d后,與空白組相比,模型組餐后血糖呈顯著性升高(p<0. 001);與模型組相比,陽性對照能顯著性的降低餐后血糖(p<0. 01),除石油醚部位高劑量組、黑莓籽油中低劑量組降低餐后血糖無顯著性差異(p>0. 05),其他給藥均能顯著性的升高餐后血糖。從劑量 - 效應關系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位餐后血糖水平逐漸降低,具有一定的劑量正效應依賴性;正丁醇部位餐后血糖逐漸降低,具有一定的劑量負效應依賴性。

與模型組相比,除黑莓籽油中劑量組能顯著性的升高空腹血糖(p<0. 01),其他各劑量組空腹血糖均無顯著性差異(p>0. 05),其中石油醚部位中低劑量組、乙酸乙酯部位高中低劑量組、正丁醇部位高低劑量組以及黑莓籽油低劑量組空腹血糖值均低于模型組。從劑量 - 效應關系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位空腹血糖水平逐漸降低,具有一定的劑量正效應依賴性;相反,乙酸乙酯部位空腹血糖水平逐漸降低,具有一定的劑量負效應依賴性。

從給藥后餐后血糖和空腹血糖綜合分析,石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和油降血糖效果不佳。但是糖尿病引起血糖升高,可以加快葡萄糖的有氧氧化、增強蛋白的非酶糖基化作用和導致脂代謝異常,使體內存在一定程度的氧化應激和脂質代謝紊亂。氧化應激會使外周組織對胰島素的敏感性下降,葡萄糖的利用降低。

表1 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠血糖的影響Table 1 Effect of the different extracts of blackberry seed on blood

注:阿卡波糖為陽性對照;與空白組比較:ΔΔΔp<0. 001,ΔΔp<0. 01,Δp<0. 05;與模型組比較:* * *p<0. 001,* *p<0. 01,*p<0. 05;與陽性對照組比較:###p<0. 001,##p<0. 01,#p<0. 05;表2 ～ 表4同。此外,氧化應激還會加劇胰島β細胞凋亡,胰島細胞數目減少,降低胰島素的合成與分泌,使糖代謝異常進一步加劇,因此,氧化應激在糖尿病的病理衍變中起重要作用?？梢?高血糖會引起糖尿病患者抗氧化系統紊亂,產生氧化應激,反過來氧化應激又會影響糖代謝,由此形成惡性循環。需要進一步研究糖尿病引起的脂質代謝紊亂和氧化應激。

2. 2 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠肝糖元的影響

由表2可以看出,給藥治療7d后與空白組相比,模型組小鼠肝糖元含量顯著性的降低(p<0. 01);與模型組相比,石油醚部位中低劑量組、乙酸乙酯部位高中劑量組、黑莓籽油低劑量組和陽性對照均能顯著性的升高肝糖元的含量(p<0. 05),其他各劑量高肝糖元的含量無顯著性差異(p>0. 05),但是肝糖元含量均高于模型組?？梢?石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和油可能具有促進肝糖元的合成,降低肝糖元的分解的作用。從劑量 - 效應關系看,隨著給藥劑量的升高,黑莓油給藥組肝糖元含量逐漸降低,具有一定的劑量負效應依賴性。

表2 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠肝糖元的影響Table 2 Effect of the different extracts of blackberry seed

2. 3 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠血脂水平的影響

由表3可以看出,給藥治療7d后與空白組相比,模型組小鼠血清中TCH含量顯著性的升高(p<0. 05);與模型組相比,陽性對照均能顯著性的降低TG(p<0. 05)和TCH的含量(p<0. 001),石油醚部位低劑量組、乙酸乙酯部位高中劑量和黑莓籽油高劑量組均能顯著性的降低TG和TCH的含量(p<0. 05),正丁醇部位低劑量組能顯著性的降低TG的含量,乙酸乙酯部位低劑量組、正丁醇部位高劑量組、黑莓籽油中低劑量組均能顯著性的降低TCH的含量(p<0. 05)?？梢?石油醚部位、乙酸乙部位、正丁醇部位和油能通過降低血清中TCH和TG的含量,來改善糖尿病并發癥—高血脂,糾正糖尿病小鼠的脂質代謝紊亂。從劑量 - 效應關系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位TG含量和TCH含量以及正丁醇部位TG含量均逐漸升高,具有一定的劑量負效應依賴性;正丁醇部位TCH含量逐漸降低,具有一定的劑量正效應依賴性。

2. 4 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠脂質過氧化水平的影響

由表4可以看出,給藥治療7d后與空白組相比,模型組小鼠血清中MDA含量顯著性升高(p<0. 01),SOD水平顯著性降低(p<0. 05),可見,糖尿病會引起機體抗氧化系統紊亂。與模型組相比,乙酸乙酯部位和黑莓籽油中劑量組均能顯著升高SOD水平(p<0. 05),石油醚部位和油的三個劑量組、乙酸乙酯部位高低劑量組以及正丁醇部位組升高SOD水平不具有顯著性(p>0. 05),但均高于模型組,石油醚部位低劑量組和正丁醇部位劑量組能顯著性的降低MDA含量(p<0. 05),石油醚部位高劑量組、乙酸乙部位高中劑量組、正丁醇部位中低劑量組以及油高劑量組降低MDA含量不具有顯著性(p>0. 05),但均低于模型組。可見,石油醚部位低劑量組、乙酸乙酯部位中劑量組和正丁醇部位中劑量組能通過不同程度的降低血清中MDA的含量,升高SOD水平,增強糖尿病小鼠機體的抗氧化功能,保護機體免受自由基的進一步傷害。從劑量 - 效應關系看,隨著給藥劑量的升高,石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和黑莓籽油降低MDA含量,升高SOD水平均不具有一定的劑量 - 效應依賴性。

表3 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠血清中TG和TCH的影響Table 3 Effect of the different extracts of blackberry seed on the levels of TG and TCH in

目前,糖尿病是一組以長期高血糖為主要特征的代謝綜合征,是由于胰島素缺乏和(或)胰島素生物作用障礙導致的糖代謝紊亂,同時伴有脂肪、蛋白質、水和電解質等代謝障礙,并可并發眼、腎、神經和心血管等多臟器慢性損害[12],并且在正常機體內存在自由基產生和清除兩個系統,共同維持機體的氧化還原穩態,如果活性氧簇產生過多和/或抗氧化酶如SOD活性下降,就可導致機體受氧化應激損傷[15]。糖尿病發生后會導致體內自由基產生大量增加,機體抗氧化防御能力也下降。

文獻[16]報道,來自天然產物中萜類、胰島素、肽和氨基酸類、黃酮類、多糖類、硫醚類、生物堿類、香豆精類和不飽和脂肪酸類等類型的化合物具有一定的降糖作用,如胡蘆巴中芹菜素黃酮苷類化合物有降血糖活性[17]、當歸多糖有降血糖作用[18]等。眾多植物中都存在清除氧自由基的抗氧化性功能因子,包含黃酮類、多酚類、原花青素類、生物堿類、維生素、植物激素和吲哚衍生物等[19 - 20]。這些類型的化學成分可能是黑莓籽較弱降糖、糾正脂質代謝紊亂和增強機體抗氧化的有效成分,但是具體是哪些化合物具有降血糖作用,需要進一步分離純化,進行研究。

表4 黑莓籽不同提取部位對糖尿病小鼠血清SOD和MDA的影響Table 4 Effect of the different extracts of blackberry seed on the content of MDA and the level

3 結論

有文獻報道,黑莓籽油具有清除DPPH自由基和羥基自由基的能力,抑制VC- FeSO4體系誘導的小鼠肝組織丙二醛生成。本研究從糖尿病引起的脂質過氧化角度進行研究,結果表明,黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位和油具有改善糖尿病小鼠的脂質代謝紊亂,增強糖尿病小鼠機體的抗氧化防御功能,保護機體免受自由基的進一步攻擊的作用。

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