分子印跡基質固相分散快速分離分析辣椒制品中的蘇丹紅

, ,,,立鋼

(東北林業大學理學院,黑龍江哈爾濱 150040)

蘇丹紅是一種非天然的化學染色劑,是人工合成的含有萘環結構的化合物,同時含有偶氮結構。由于其色彩鮮澤,常用于工業染料方面。蘇丹紅被國際癌癥研究機構歸類為三類致癌物質即動物致癌物,對人類也有潛在的危害。而且毒理學相關研究表明,蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ有致突變性和致癌性,美國歐盟等都已明文規定禁止將蘇丹紅添加到食品中,近年來我國也禁止將它使用在相關食品添加劑中[1 - 3]。目前常用HPLC、GC/MS、LC/MS、GPC/LC、極譜法、ELISA等方法對食品中的蘇丹紅進行檢測。傳統的實驗方法,檢測靈敏度差,耗時長。本實驗是采用分子印跡技術(MIT)和基質固相分散萃取(MSPD)聯用的一種新型檢測蘇丹紅的方法。分子印跡技術目前是比較成熟的一門科學技術,始于生物化學,材料科學等學科,在色譜分離,固相萃取,食品檢驗和環境監測等都有十分廣泛的應用[4 - 6]。制備得到的分子印跡聚合物(MIP)擁有預定性,特異識別性和廣泛使用性三個特點。在已有的報道中,蘇丹紅 - 分子印跡聚合物已經被成功制備出來,并且作為固相萃取的吸附劑萃取分離辣椒等樣品中的蘇丹紅[7 - 9]。然而,在制備過程中,大多采用的是本體聚合技術,得到的聚合物,模板分子包埋過深,不利于洗脫和再結合。并且,在應用之前,需采用一定的溶劑將蘇丹紅從固體樣品中提取出來,然后再進一步進行固相萃取凈化處理,步驟繁瑣。本實驗采用表面印跡技術,以納米SiO2為載體,蘇丹紅IV為模版分子,甲基丙烯酸為功能單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑制備分子印跡聚合物。表面印跡技術可以很好的解決傳統的本體聚合帶來的模板分子包埋過深等問題。所得分子印跡物作為基質固相萃取中的吸附劑萃取辣椒制品中的蘇丹紅?；|固相分散技術具有快速簡便,集萃取、凈化、濃縮于一體,而且樣品和提取溶劑用量少,環境污染少等優點[10]。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

二甲基丙烯酸乙二醇酯 美國Sigma - Aldrich;蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ標準品、硅烷偶聯劑KH570 上海阿拉丁;偶氮二異丁腈、甲醇、乙醇甲基丙烯酸、乙酸、98%濃硫酸 天津科密歐;乙腈 色譜純,美國Fisher;納米SiO2宣城晶瑞;實驗用水為去離子水。實驗中所用到的辣椒面和辣椒醬樣品均購買于哈爾濱當地的農貿市場。

H7650電子顯微鏡 日本日立公司;LC - 15C液相色譜 日本島津公司;HSY - B 恒溫振蕩搖床 金壇市精達儀器制造廠;FT - IR360傅立葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司;DZKW - C恒溫水浴鍋 上海樹立公司。

1. 2 標準溶液的制備

在100mL甲醇中分別溶解5. 0mg蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ配制得到50μg/mL標準溶液,保存在冰箱中。

1. 3 分子印跡聚合物的制備

將KH570在純甲苯(25mL),蒸餾水(8mL)和98%濃硫酸(6. 5mL)中65℃水解4h,分液漏斗去水層,再加入納米SiO2(1. 0g),98%濃硫酸(2mL)在油浴中114℃條件下反應4h。純甲醇洗滌離心干燥10h制得SiO2- KH570。取模板分子蘇丹紅Ⅳ(1mmol)加入功能單體甲基丙烯酸(4mmol)和氯仿(20mL)的混合液中攪拌1h。再加入交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(20mmol)和引發劑偶氮二異丁腈(0. 06g),SiO2- KH570(1. 0g)在磁力攪拌300r/min水浴60℃下反應24h。合成后的產物用純甲醇洗滌離心多次后,置于60℃烘箱中干燥。以20%乙酸甲醇為溶劑對產物進行索氏提取至無色,最后真空干燥,即得到分子印跡聚合物MIP。而非分子印跡聚合物NIP與MIP制備方法一樣,只是不加入模板分子蘇丹紅Ⅳ。

1. 4 MIP和NIP吸附等溫線的測定

分別在2. 0mL不同濃度的蘇丹紅IV溶液中加入MIP和NIP 20. 0mg,恒溫震蕩24h,離心后用HPLC檢測蘇丹紅IV的剩余濃度。

1. 5 MIP和NIP的動力學考察

稱取MIP和NIP各20. 0mg與2. 0mL蘇丹紅Ⅳ標準溶液振蕩1、3、4、5、7、9min,離心后用HPLC檢測蘇丹紅Ⅳ的剩余濃度。

1. 6 基質固相分散萃取分離辣椒制品中蘇丹紅

稱取辣椒面0. 05g,分子印跡聚合物0. 05g,在研缽中混合研磨8min。轉移到空的注射器中,用4mL 5%的乙酸乙醇進行洗脫,用HPLC檢測洗脫液中蘇丹紅的含量。

實驗中優化了影響萃取蘇丹紅的各種因素,采用的是單因變量法,即在固定其它條件下,改變某一條件,研究其對萃取效果的影響。以四種蘇丹紅的回收率為考量指標,能夠得到最佳蘇丹紅回收率的條件即為最優條件?？疾斓妮腿l件包括MIP與辣椒面比例(1/2,1/1,3/2,2/1,5/2,3/1),研磨時間(2、4、6、8、10min),洗脫劑種類(純甲醇、1%乙酸甲醇、5%乙酸甲醇、純乙醇、1%乙酸乙醇、5%乙酸乙醇)和洗脫體積(1、2、3、4、5、6、7mL)。

1. 7 液相色譜分析

安捷倫SB - C18色譜柱(150mm × 4. 6mm,5μm);進樣量20μL;流動相為純乙腈;流速1. 0mL/min;檢測波長505nm。

2 結果與分析

2. 1 分析印跡聚合物的表征

分子印跡聚合物的電鏡圖如圖1所示,徑粒分布大小均勻,大約為40 ～ 50nm。分子印跡聚合物和二氧化硅的紅外光譜圖如圖2所示。對于分子印跡聚合物,3435cm-1處為O - H的伸縮振動吸收峰;2956cm-1處為C - H的伸縮振動吸收峰;1731cm-1處為C=O伸縮振動吸收峰;1456cm-1和1386cm-1處為C - H彎曲振動吸收峰;1155cm-1處為Si - O振動吸收峰。對于二氧化硅,3418cm-1處為O - H的伸縮振動吸收峰;1132cm-1處為Si - O振動吸收峰。

圖1 分子印跡聚合物的透射電鏡圖Fig. 1 The TEM image of MIP

圖2 分子印跡聚合物的紅外譜圖Fig. 2 FTIR spectra of MIP

2. 2 吸附等溫的測定和Scatchard分析

吸附到聚合物上蘇丹紅Ⅳ的量為Q(mg/g)。計算公式為:Q=(Ci-Cf)V/m;Ci(mg/L)為蘇丹紅Ⅳ的初始濃度;Cf(mg/L)為蘇丹紅Ⅳ的平衡濃度;V(mL)為吸附溶液的體積;m為聚合物的質量(mg)。

聚合物對蘇丹紅IV的平衡吸附量隨著蘇丹紅IV濃度的增加而增加(圖3)。進一步將該結果進行Scatchard分析,擬合方程為Q/Cf=(Qmax-Q)/Kd。式中,Q(mg/g)為聚合物對蘇丹紅Ⅳ的吸附量;Cf(mg/L)為蘇丹紅Ⅳ的平衡濃度;Qmax(mg/g)為最大表觀結合量;Kd(mg/L)為結合位點的平衡離解常數。以Q/Cf對Q作圖(圖4)。在測定的濃度范圍內,對于MIP而言,可以擬合出兩條線性關系(圖4a),即MIP對模板分子存在兩種結合位點。MIP這兩種結合位點的最大表觀結合量和平衡離解常數分別為Qmax1=0. 8306mg/g,Kd1=4. 760mg/L;Qmax2=4. 146mg/g,Kd2=112. 4mg/L。對NIP進行擬合只能得到一條線性關系(圖4b),即NIP對模板分子只有一種結合方式,經計算得到的最大表觀結合量和平衡離解常數分別為Qmax=0. 8692mg/g;Kd=29. 07mg/L。

圖3 MIP及NIP對蘇丹紅IV的吸附等溫線Fig. 3 Binding isotherms of MIP and NIP

圖4 MIP(a)和NIP(b)Scatchard分析曲線Fig. 4 Scatchard plot analysis of MIP(a)and NIP(b)

2. 3 吸附動力學考察

由實驗數據得到聚合物對蘇丹紅在不同時間內的吸收量Qt(mg/g),結果如圖5所示。

圖5 MIP和NIP吸附動力學結果Fig. 5 The kinetic curves of MIP and NIP

分別對數據進行準一級動力學和準二級動力學擬合,擬合方程分別為:ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t和t/Qt=1/k2Qe2+t/Qe。式中,Qt(mg/g)是不同時間的吸收量,Qe(mg/g)是平衡時的吸附量,k1(min-1)和k2(g·mg-1·min-1)分別是準一級和準二級動力學的吸收速率常數。

對MIP和NIP分別由ln(Qe-Qt)對t作圖(圖6a)進行準一級動力學擬合得到直線y= - 0. 0099x+3. 677,R2=0. 632和y= - 0. 0158x+3. 4306,R2=0. 8037。對MIP和NIP分別由t/Qt對t作圖(圖6b)進行準二級動力學擬合得到直線y=0. 1451x+0. 0542,R2=0. 9995和y=0. 0856x+0. 0266,R2=0. 999。由結果可知MIP和NIP對蘇丹紅的吸收均符合準二級動力學吸附模型。

2. 4 萃取條件的優化

應用制備得到的MIP作為基質固相分散的吸附劑對辣椒面中的4種蘇丹紅進行萃取,優化了影響萃取結果的條件。實驗結果顯示,當MIP與辣椒制品比例為1∶ 1,研磨時間為8min,采用4mL 5%乙酸乙醇作為洗脫劑得到的蘇丹紅萃取效果最佳。

2. 5 分析方法評價及應用

采用液相色譜檢測4種蘇丹紅,色譜圖如圖7所示。線性范圍為0. 05 ～ 10μg/mL。蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的檢出限分別為0. 016,0. 015,0. 011和0. 010μg/mL。精密度的考察是通過對同一批辣椒樣品連續分析6次,得到測定蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的相對標準偏差RSD分別為4. 8%,3. 2%,5. 4%和5. 0%。本實驗又對樣品進行了加標回收實驗,得到的蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的加標回收率分別為96. 4%,95. 7%,94. 4%和98. 3%。從哈爾濱市場上購買了5種辣椒面和5種辣椒醬,應用此方法進行檢測,均未發現蘇丹紅的存在。隨后我們對這些樣品進行了蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的加標回收實驗,得到的四種蘇丹紅的回收率在94. 7% ～ 98. 4%范圍內,證明了本方法可以很好的應用于不同辣椒樣品基質的分析中。

3 結論

本實驗以蘇丹紅Ⅳ為模板分子,以表面印跡法制備得到了分子印跡聚合物。對其進行了吸附等溫線的測定,Scatchard分析以及動力學分析。最后將其應用于基質固相分散的吸附劑萃取分離辣椒制品的4種蘇丹紅。由于蘇丹紅Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的結構式類似,因此4種蘇丹紅均能被所合成的MIP提取出來,且得到了較高的回收率。該方法減少了樣品預處理的步驟,快速、準確、靈敏度高。

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