乙醇傳感器法測定葡萄酒和黃酒中乙醇的含量

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(1. 齊魯工業大學食品與生物工程學院,山東濟南 250353; 2. 中國食品發酵工業研究院,北京 100015; 3. 全國食品發酵標準化中心,北京 100015)

葡萄酒中的乙醇是酵母菌利用葡萄漿果中的糖進行發酵的主要產物,乙醇的含量通常為7% ～ 16% vol,一些自然甜型葡萄酒和加強葡萄酒的酒精含量可達到23%vol。黃酒是世界上最古老的酒類之一,與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒。黃酒中乙醇主要是酵母作糖化劑,利用稻米等原料產生的,黃酒中乙醇含量一般在10% ～ 20% vol。乙醇含量的測定是酒精飲料質量控制的關鍵之一。目前國家標準中測定葡萄酒和黃酒中乙醇的方法主要采用密度瓶法、酒精計法和氣相色譜法[1 - 4],常見的乙醇快速檢測方法主要有近紅外光譜法[5 - 6]、分光光度分析法[7]、催化動力學光度法[8 - 9]、熱值分析法[10]、分光光度酶法[11]等。密度瓶法和酒精計法需對樣品進行蒸餾,且操作過程繁瑣;而氣相色譜法存在成本較高、操作繁瑣、測定時間長等缺點;近紅外光譜法樣品無需前處理,測定速度快,但是建模難度大,定標樣品的選擇、制備,精確的化學分析,基礎數據的準確性以及選擇計量學方法的合理性,都將直接影響最終的分析結果;光度法和熱值分析法準確度較低。因此,有必要建立一種快速、準確的乙醇測量方法以滿足行業需求。

生物傳感器(Biosensor)是由具分子識別功能的生物材料、換能器和信號放大裝置構成的分析工具。主要原理是利用酶等生物活性物質作為傳感器的敏感元件,與待測物質發生反應,然后通過換能器將反應轉換成可以輸出檢測的電信號,其大小與待測物的濃度成正比,通過分析信號從而實現對被測物的定量。生物傳感器分析具有操作簡單度快、特異性好、靈敏度高等特點,已應用于發酵產品中乳酸和葡萄糖[12 - 13]等的快速檢測。本文采用生物傳感器法對葡萄酒和黃酒中乙醇的檢測進行研究,建立適合于酒類企業對生產過程及產品質量進行測定的快速檢測方法。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

乙醇氧化酶(EC 1. 1. 3. 13,38units/mg) 購于美國sigma公司;核微孔膜(孔徑0. 2μm,直徑9mm) 美國Nucleopore公司;王朝干紅葡萄酒(酒精度14% vol);張裕干紅葡萄酒(酒精度15% vol);長城干白葡萄酒(酒精度12% vol);石庫門上海老黃酒(酒精度≥10%vol);古越龍山五年陳花雕酒(酒精度≥12% vol);戊二醛(40%)、無水乙醇 均為分析純;實驗用水 蒸餾水。

生物傳感分析儀(SBA40C型) 山東省科學院生物研究所;分析天平(AB - 204N) 梅特勒。

1. 2 檢測原理

主要原理是利用乙醇氧化酶作為傳感器的敏感元件,與樣品中的乙醇反應生成H2O2,在過氧化氫電極產生電流,其大小與待測物的濃度成正比,從而實現對被測物的定量[14]。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 固定化乙醇氧化酶膜制備 將5μL乙醇氧化酶滴涂在核微孔基質膜(直徑9mm)上形成6mm酶層圓斑,4℃下在戊二醛(40%)蒸汽中交聯反應12h,制成乙醇氧化酶膜[15]。

1. 3. 2 乙醇生物傳感分析儀定標 采用20μL/100mL的乙醇標準溶液作為儀器定標溶液,取25μL儀器定標溶液進樣,當前后兩次測定的響應值的相對誤差小于1. 5%時,儀器自動定標通過,并記錄相應的響應值。如定標未通過,需要再連續采用定標液進樣,直至定標通過方可進行樣品的測定。

1. 3. 3 樣品測定 樣品用0. 1mmol/L,pH7. 2的磷酸緩沖液稀釋1000倍,使乙醇含量在傳感器的響應線性范圍內,然后準確吸取25μL稀釋后的酒樣注入反應池中,記錄測量結果,根據樣品的稀釋倍數計算酒樣中乙醇含量。

1. 3. 4 線性范圍 將無水乙醇用磷酸緩沖液(0. 1mmol/L pH7. 2)配制濃度梯度為2、4、6、8、10、20、40、60、80μL/100mL的乙醇系列標準溶液,取25μL配制的乙醇系列標準溶液進行測定,每個濃度重復進樣3次,以乙醇標準溶液濃度為橫坐標,測量結果為縱坐標,繪制標準曲線,確定線性范圍。

1. 3. 5 pH對酶活的影響 分別采用pH=6. 0、6. 5、7. 0、7. 5和8. 0磷酸緩沖液作為酶膜的介質,以40μL/100mL乙醇標準溶液為測試液(乙醇標準溶液與酶膜的介質的pH保持一致),記錄乙醇酶膜活性相應值,研究介質pH對酶活的影響。

1. 3. 6 方法的加標回收率 分別向稀釋1000倍后的酒樣中添加一定濃度的乙醇標準溶液,進行加標回收率實驗。

1. 3. 7 干擾實驗 黃酒和葡萄酒中其它共存化合物的最高濃度不超過80g/L[16 - 17],稀釋1000倍后不超過為80mg/L;而甲醇最高濃度不超過0. 1g/L[18 - 19],稀釋1000倍后最高為0. 1mg/L,為了考察酒中存在的其他物質對傳感器的影響,實驗分別配制20μL/100mL的乙醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸、β - 苯乙醇、抗壞血酸的各單組分溶液和0. 2μL/100mL甲醇溶液進行測定,以乙醇的響應值為基準值100%,記錄其它組分的相對響應值。

1. 3. 8 乙醇氧化酶膜穩定性研究 將乙醇氧化酶膜安裝在電極上,對該膜在室溫下的穩定性進行了研究,每次進同一濃度的乙醇溶液,連續測量13d。

2 結果與討論

2. 1 線性范圍

由圖1可知,當乙醇濃度為2 ～ 80μL/100mL時,乙醇濃度和測量值具有良好的線性關系,回歸方程為y=0. 9849x+0. 0202,相關系數R2=0. 9997。

圖1 乙醇生物傳感器的標準曲線Fig. 1 The standard curve of ethanol biosensor

2. 2 pH對酶活的影響

酶是一種蛋白質,介質的pH會影響酶的活性,過酸或過堿的介質會導致酶的活性下降,甚至失活。pH對乙醇傳感器酶活的影響實驗結果如圖2所示,pH在7. 0 ～ 7. 5時乙醇酶膜活性最高,與文獻報導一致[20 - 21],本實驗選擇pH7. 2的磷酸緩沖液作為乙醇傳感器介質溶液和樣品稀釋液。

表1 生物傳感器測定葡萄酒和黃酒中乙醇的加標回收率(n=3)Table 1 Recovery test of alcohol in wine and rice wine by biosensor(n=3)

表2 生物傳感器測定葡萄酒和黃酒中乙醇含量的精密度測定結果(n=4)Table 2 Precision test of alcohol in wine and rice wine by biosensor(n=4)

圖2 pH對乙醇氧化酶活性的影響Fig. 2 The effect of pH on alcohol oxidase activity

2. 3 加標回收率

如表1所示,乙醇加標回收率在99. 22% ～101. 59%之間,表明該方法檢測結果準確,可定量檢測葡萄酒和黃酒中乙醇含量,結果見表1。

2. 4 精密度、重復性測定

每個酒樣重復進樣4次,計算平均值,相對標準偏差,研究了傳感器的重復性和精密度,結果見表2。由表可知,傳感器的精密度和重復性較好,RSD值小于1%。

2. 5 干擾實驗

由表3可知其樣品中其它共存組分對乙醇的測量結果沒有影響,說明傳感器的抗干擾能力較好。

表4 乙醇傳感器和酒精計法對樣品的測定結果(n=6)Table 4 The determination results of samples by ethanol biosensor and alcohol meter method(n=6)

注:表中數值是已按稀釋比例換算成的實際乙醇濃度。

表3 乙醇傳感器的抗干擾性(n=3)Table 3 The anti - interference performance of ethanol biosensor(n=3)

2. 6 酶膜穩定性研究

如圖3所示,酶電極在室溫下13d后酶電極的響應值仍剩初始值的76%,并且對同一濃度的乙醇溶液連續測量6次,RSD值為4. 61%,說明乙醇氧化酶膜可在室溫下,13d內保持良好的穩定性。

圖3 乙醇傳感器的穩定性Fig. 3 The stability of ethanol biosensor

2. 7 乙醇傳感器法和酒精計法間的比較

利用乙醇傳感器法和國標酒精計法分別對3種葡萄酒和2種黃酒進行分析,結果如表4所示,并對兩種方法測量的結果進行t - 檢驗,得到的p值大于0. 05,說明兩種方法測量結果無顯著性差異。

3 結論

本文建立了乙醇生物傳感器法測定葡萄酒和黃酒中乙醇含量的方法,該方法的線性范圍為2 ～80μL/100mL,精密度和重復性RSD小于1. 0%,加標回收率在99. 22% ～ 101. 59%之間,且具有很好的抗干擾能力,與酒精計法測定結果相關性良好,用t - 檢驗分析,無顯著性差異。本方法的建立為酒類企業的產品快速檢驗或酒類生產過程質量控制提供有效的途徑。

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