利用雙重PCR同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌和沙門氏菌方法的建立

, ,, ， ,

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2. 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047; 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,江西南昌 330004)

2004年,聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)對(duì)嬰幼兒配方奶粉中可能存在的病原微生物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后,認(rèn)為嬰幼兒配方奶粉中的克羅諾桿菌和沙門氏菌污染是導(dǎo)致嬰幼兒感染疾病和死亡的主要原因,并將克羅諾桿菌和沙門氏菌定義為嬰幼兒配方奶粉中的“A類致病菌”[1]。

克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)是一類食源性條件致病菌[2],能夠引起新生兒腦膜炎、菌血癥和小腸結(jié)腸炎,特別是28d以內(nèi)的早產(chǎn)兒、體重較輕或免疫缺陷的嬰幼兒更容易被感染,死亡率高達(dá)50%以上[3 - 4]。進(jìn)行溯源分析后,認(rèn)定嬰幼兒配方奶粉是其最主要的傳播途徑[5]。沙門氏菌是最常見的食源性人獸共患病原菌,能導(dǎo)致人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒[6],我國內(nèi)陸地區(qū)細(xì)菌性食物中毒中有70% ～ 80%是由沙門氏菌引起的[7]。

近些年,關(guān)于嬰幼兒配方奶粉中可能存在的兩種“A類致病菌”引起感染的報(bào)道越來越多,但同時(shí)檢測(cè)兩種致病菌的方法較少。僅有Hyeon等[8]利用熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)對(duì)奶粉中克羅諾桿菌菌和沙門氏菌的同時(shí)檢測(cè),但需長達(dá)12h的預(yù)增菌處理,檢測(cè)限才均能達(dá)到100CFU/g。大多單一檢測(cè)方法也需要長時(shí)間的預(yù)增菌培養(yǎng)[9 - 10],很難滿足病原菌快速檢測(cè)的要求[11 - 12]。因此,亟需快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的聯(lián)合檢測(cè)奶粉中克羅諾桿菌和沙門氏菌的方法。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌種及雙重PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Bacteria used in this study and the results of duplex - PCR specificity test

注:+表示d - PCR檢測(cè)結(jié)果陽性; - 表示d - PCR檢測(cè)結(jié)果陰性。

本文利用克羅諾桿菌和沙門氏菌的特異性引物結(jié)合雙重PCR反應(yīng),建立了一種能夠準(zhǔn)確、快速地同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒配方中的克羅諾桿菌和沙門氏菌的方法。對(duì)于預(yù)防和控制病原菌的流行,保障嬰幼兒食品安全,具有至關(guān)重要的意義。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)涉及20株克羅諾桿菌、4株沙門氏菌以及18株其它食源性致病菌或益生菌,所用菌株均由食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,具體菌株見表1。

LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基 環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司;沙門氏菌顯色培養(yǎng)基 青島海博生物公司;Taq mastermix TaKaRa公司;嬰幼兒配方奶粉 南昌市周圍超市。

高溫蒸汽壓力滅菌鍋 上海博訊;渦旋振蕩器 上海奇特; - 70℃超低溫冰箱 Thermo USA,PCR儀 Eppendorf Germany;電泳儀 Bio - RAD USA;普通低溫冰箱 青島海爾;超純水儀 Millipore USA;微量移液器 Eppendorf Germany;凝膠成像分析系統(tǒng) Bio - RAD USA;電子天平 上海良平;ZHWY - A2102C恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;YQX - II型厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA提取 克羅諾桿菌與沙門氏菌均采用普通Luria - Bertani(LB)液體培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器180r/min過夜培養(yǎng),其他菌株采用LB或MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取2mL過夜菌懸液,用天根公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,所提取DNA溶于20μL無菌水中, - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 雙重PCR引物設(shè)計(jì) 分別根據(jù)GenBank登陸號(hào)為NR044060. 1和HG326213. 1中的基因序列,利用在線NCBI公共數(shù)據(jù)庫運(yùn)用OMIGA軟件設(shè)計(jì)克羅諾桿菌和沙門氏菌的特異性引物并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(見表2)。

1. 2. 3 雙重PCR反應(yīng)體系及條件 雙重PCR反應(yīng)體系(25μL)為:2. 5×Taqmastermix 10μL,引物Cro- F、Cro- R、InvA- F、InvA- R(濃度均為10μmol/L)各0. 3μL,DNA模板溶液5μL,加水補(bǔ)足至25μL。混和均勻后,按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán);最后72℃充分延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1. 5%(w/v)的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)(電泳條件為5V/cm),利用凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 2 d - PCR Primers used in this study

1. 2. 4 雙重PCR特異性檢測(cè)

1. 2. 4. 1 引物特異性檢測(cè) 以全部實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA為模板,按上述雙重PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增并電泳檢測(cè)。

1. 2. 4. 2 目標(biāo)菌株交叉實(shí)驗(yàn) 以克羅諾桿菌和沙門氏菌作為對(duì)比分析對(duì)象,進(jìn)行目標(biāo)細(xì)菌交叉實(shí)驗(yàn)(見表3),兩種細(xì)菌濃度均為104CFU/mL,按上述條件和方法進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增并電泳檢測(cè)。

表3 目標(biāo)細(xì)菌交叉實(shí)驗(yàn)Table 3 Target bacteria cross - over test

注:表中○表示未添加細(xì)菌,表中●表示添加細(xì)菌。

1. 2. 5 奶粉樣本靈敏度檢測(cè) 在無菌奶粉樣品中分別添加克羅諾桿菌ATCC 29544和相同濃度鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311,使兩種致病菌濃度均為100、101、102、103、104、105、106、107CFU/g,取1g人工污染的奶粉樣本接種于10mLLB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器180r/min進(jìn)行培養(yǎng),選取2、4、6、8h為四個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按1. 2. 1方法提取增菌液中細(xì)菌基因組DNA作為擴(kuò)增模板,進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)。用未人為添加致病菌的無菌嬰幼兒配方奶粉,按相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),作為陰性對(duì)照。

1. 2. 6 高濃度雜菌干擾實(shí)驗(yàn) 在1. 2. 5中人工污染相同濃度的克羅諾桿菌ATCC29544和鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311的奶粉樣本中加入106CFU/g腸致病性大腸桿菌CMCC44496,經(jīng)4h增菌,提取基因組DNA后進(jìn)行雙重PCR檢測(cè),考察高濃度雜菌對(duì)雙重PCR檢測(cè)方法靈敏度的影響。

1. 2. 7 人工污染嬰幼兒配方奶粉樣本檢測(cè) 在40份無菌嬰兒配方奶粉中人工隨機(jī)摻雜不同濃度克羅諾桿菌(100～ 106CFU/g)和不同濃度沙門氏菌純培養(yǎng)物(100～ 106CFU/g);在20份無菌嬰兒配方奶粉中人工摻雜不同濃度克羅諾桿菌(100～ 104CFU/g);在20份無菌嬰兒配方奶粉中人工摻雜不同濃度沙門氏菌(100～ 106CFU/g);共制備人工污染樣本80份,無菌嬰兒配方奶粉樣本20份。總計(jì)100份檢測(cè)樣本根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣本處理及檢測(cè)。同時(shí)依據(jù)FDA分離鑒定克羅諾桿菌和沙門氏菌的方法分別進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雙重PCR檢測(cè)的特異性

2. 1. 1 引物的特異性 為檢測(cè)引物特異性,20株克羅諾桿菌、5株沙門氏菌及18株其他食源性致病菌或益生菌經(jīng)過夜培養(yǎng)后,提取菌株DNA作為PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板,按上述雙重PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)后如表1所示,全部20株克羅諾桿菌、4株沙門氏菌樣本均得到條帶單一、位置正確的電泳條帶,而其他18株其他食源性致病菌或益生菌樣本均無條帶產(chǎn)生。電泳結(jié)果表明引物Cro和InvA均具備良好特異性,符合雙重PCR實(shí)驗(yàn)特異性要求。

2. 1. 2 交叉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為檢測(cè)雙重PCR反應(yīng)引物之間是否存在交叉影響,因此,針對(duì)克羅諾桿菌和沙門氏菌進(jìn)行交叉檢測(cè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖1所示,雙重PCR單一檢測(cè)克羅諾桿菌或沙門氏菌均得到大小正確、條帶單一的擴(kuò)增產(chǎn)物;雙重PCR聯(lián)合檢測(cè)克羅諾桿菌和沙門氏菌混合樣本,得到兩條條帶清晰、位置正確的擴(kuò)增產(chǎn)物;雙重PCR檢測(cè)陰性樣本,無擴(kuò)增條帶。因此,克羅諾桿菌和沙門氏菌交叉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,引物Cro和InvA均無交叉干擾,能夠滿足實(shí)驗(yàn)特異性要求。

圖1 交叉檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig. 1 The results of target bacteria cross - over test注:M:DL2000 marker;1,2,3,4分別對(duì)應(yīng)表3中組合。

2. 2 雙重PCR檢測(cè)的靈敏度

為檢測(cè)雙重PCR反應(yīng)的靈敏度,同等濃度的克羅諾桿菌和沙門氏菌混合奶粉溶液樣本在經(jīng)過增菌、基因組DNA提取后,進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增并電泳檢測(cè)。接種低濃度目標(biāo)菌株的增菌液在培養(yǎng)2、4、6、8h后的檢測(cè)結(jié)果如表4所示,接種量均為100CFU/g的兩種目標(biāo)菌種在兩個(gè)小時(shí)增菌后均未檢出,四個(gè)小時(shí)增菌后均能夠檢出。接種量為101CFU/g的兩種目標(biāo)菌種在兩個(gè)小時(shí)增菌后均可檢出,因此,選取4h為預(yù)增菌時(shí)間。

表5 人工污染奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果Table 5 The detection of Cronobacter in artificially contaminated PIF

不同濃度接種量的增菌液培養(yǎng)4h后,按上述方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示,初始濃度均為100CFU/g的克羅諾桿菌和沙門氏菌可同時(shí)被檢測(cè)到。雙重PCR檢測(cè)對(duì)兩種食源性致病菌的靈敏度均為初始濃度100CFU/g。

表4 增菌后d - PCR檢測(cè)克羅諾桿菌和沙門氏菌結(jié)果Table 4 The detection results of d - PCR after enrichment

注:“+”表示兩種目標(biāo)菌株均可檢測(cè)到,“ - ”表示兩種目標(biāo)菌株均不可檢測(cè)到或只可檢測(cè)到一種。

圖2 雙重PCR靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig. 2 The detection sensitivity results of d - PCR注:M:DL2000 marker;N:陰性對(duì)照;1,2,3,4,5,6,7,8,9表示克羅諾桿菌和沙門氏菌的初始接種量均為107,106,105,104,103,102,101,100,0CFU/g的嬰兒配方奶粉樣本。

2. 3 雙重PCR抗高濃度雜菌干擾能力檢測(cè)結(jié)果

為排除高濃度雜菌對(duì)雙重PCR檢測(cè)造成干擾的可能性,在同等濃度的克羅諾桿菌和沙門氏菌的混合奶粉稀釋樣本(100～ 104CFU/g)中摻入106CFU/g腸致病性大腸桿菌(CMCC44496)后,按上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示,該方法最低檢測(cè)限仍可達(dá)到100CFU/g,說明雙重PCR具備抗高濃度雜菌干擾能力。

圖3 雙重PCR抗干擾能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig. 3 The anti - interference ability test results of d - PCR注:M:DL2000 marker;N:陰性對(duì)照;1,2,3,4,5,6表示克羅諾桿菌和沙門氏菌的初始接種量均為104,103,102,101,100,0CFU/g并混有106CFU/g腸致病性大腸桿菌的嬰兒配方奶粉樣本。

2. 4 人工污染的嬰幼兒配方奶粉樣本檢測(cè)結(jié)果

與FDA檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比分析后,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示,在對(duì)80份人工污染和20份無污染的嬰幼兒配方奶粉樣本檢測(cè)中,均無假陽性結(jié)果。在克羅諾桿菌和沙門氏菌混合陽性樣本檢測(cè)中,克羅諾桿菌檢測(cè)準(zhǔn)確率為97. 5%,沙門氏菌檢測(cè)準(zhǔn)確率為95%;在克羅諾桿菌陽性樣本檢測(cè)中,克羅諾桿菌檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%,沙門氏菌檢測(cè)準(zhǔn)出率為0%;在沙門氏菌陽性樣本檢測(cè)中,克羅諾桿菌檢測(cè)準(zhǔn)出率為0%,沙門氏菌檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%;在陰性樣本檢測(cè)中,克羅諾桿菌、沙門氏菌均無檢出。人工污染的嬰幼兒配方奶粉樣本檢測(cè)中,無假陽性出現(xiàn)。由此可知,雙重PCR方法檢測(cè)克羅諾桿菌和沙門氏菌的準(zhǔn)確率均在95%以上。

3 結(jié)論

PCR檢測(cè)方法的特異性主要取決于相應(yīng)檢測(cè)靶點(diǎn)的選擇和特異性引物的設(shè)計(jì)[13],本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分別針對(duì)克羅諾桿菌和沙門氏菌的引物,在特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中均展示出良好的特異性,同時(shí)二者不會(huì)產(chǎn)生交叉干擾,符合雙重PCR反應(yīng)要求。與傳統(tǒng)的單一致病菌檢測(cè)相比,本研究建立的雙重PCR檢測(cè)體系可以在6h左右(包括4h增菌,30min基因組提取和1h30minPCR擴(kuò)增檢測(cè)),完成對(duì)奶粉中的2種重要食源性致病菌的聯(lián)合檢測(cè),而且結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,節(jié)省檢測(cè)時(shí)間的同時(shí),也減少試劑耗材的消耗,具有高效和經(jīng)濟(jì)簡便的優(yōu)點(diǎn)。該方法不需配置熒光定量PCR儀等昂貴的儀器設(shè)備,只需普通PCR儀、電泳儀,適合基層實(shí)驗(yàn)室使用,為食品微生物安全的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等提供技術(shù)手段。同時(shí)也為突發(fā)衛(wèi)生事件中致病菌的分離鑒定和溯源提供強(qiáng)有力的證據(jù),具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

[1]Healy B,Cooney S,O’Brien S,etal.Cronobacter(Enterobacter sakazakii):An Opportunistic Foodborne Pathogen[J]. Foodborne Pathog Dis,2010,7(4):339 - 350.

[2]Urmenyi AM,Franklin AW. Neonatal death from pigmented coliform infection[J]. Lancet,1961,1(7172):313 - 315.

[3]Clark NC,Hill BC,O’Hara CM,etal. Epidemiologic typing of Enterobacter sakazakii in two neonatal nosocomial outbreaks[J]. Diagn Micr Infec Dis,1990,13(6):467 - 472.

[4]Lehner A,Stephan R. Microbiological,epidemiological,and food safety aspects of Enterobacter sakazakii[J]. J Food Protect,2004,67(12):2850 - 2857.

[5]Bowen AB,Braden CR. Invasive Enterobacter sakazakii disease in infants[J]. Emerging Infectious Diseases,2006,12(8):1185 - 1189.

[6]Coburn B,Grassl GA,Finlay BB. Salmonella,the host and disease:a brief review[J]. Immunol Cell Biol,2006,85(2):112 - 118.

[7]牟成惠,陳淑云. 一起飲食服務(wù)人員沙門菌攜帶率的調(diào)查[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué),2007,7(7):1231 - 1231.

[8]Hyeon J - Y,Park C,Choi I - S,etal. Development of multiplex real - time PCR with Internal amplification control for simultaneous detection ofSalmonellaandCronobacterin powdered infant formula[J]. Int J Food Microbiol,2010,144(1):177 - 181.

[9]Ye Y,Wu Q,Zhang J,etal. Detection of ViableCronobacterspp. (Enterobacter sakazakii)by One - Step RT - PCR in Dry Aquatic Product[J]. J Food Sci,2012,77(11):M616 - M619.

[10]Alvarez J,Sota M,Vivanco AB,etal. Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing ofSalmonellain human clinical samples[J]. J Clin Microbiol, 2004,42(4):1734 - 1738.

[11]董曉暉,吳清平,莫樹平,等. 克羅諾桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,31(1):130 - 136.

[12]黎敏英,鄧樹軒,葉朗光,等. 沙門氏菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 畜牧與飼料科學(xué),2009,30(3):138 - 139.

[13]宋艷,李建林,鄭鐵松,等. 食源性致病菌PCR檢測(cè)中常用的靶基因及其參考引物[J]. 食品工業(yè)科技，2011,32(1):371 - 376.