紅笛鯛p38β MAPK基因的克隆及原核表達

夏洪麗蔡佳魯義善簡紀(jì)常吳灶和

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

紅笛鯛p38β MAPK基因的克隆及原核表達

夏洪麗1，2，3蔡佳1，2，3魯義善1，2，3簡紀(jì)常1，2，3吳灶和2，3，4

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

魚類p38 MAPK基因在宿主免疫調(diào)控及抵御病原侵染的過程中具有重要作用。利用RACE技術(shù)克隆了紅笛鯛p38β MAPK基因（Ls-p38β，GenBank登錄號為KJ502277）。序列分析結(jié)果顯示，Ls-p38β cDNA全長1 628 bp，開放閱讀框1 086 bp，可編碼361個氨基酸，預(yù)測其編碼蛋白的分子量為41.6 kD，理論等電點為5.74。該基因推導(dǎo)的氨基酸序列含有p38 MAPK家族保守的雙磷酸化激活環(huán)（TGY），與尼羅羅非魚的p38β有97%的相似性。將此基因定向插入原核表達載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32-p38β后導(dǎo)入BL21（DE3）菌株，利用IPTG進行誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE與Western blot分析顯示約在60 kD出現(xiàn)特異蛋白條帶，與預(yù)期分子量大小相符，說明Ls-p38β 融合蛋白表達成功。

紅笛鯛 p38β 絲裂原活化蛋白激酶 原核表達

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是生物體內(nèi)一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［1］，它可通過磷酸化作用將胞外信號轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)，從而激活一系列的轉(zhuǎn)錄因子或其他效應(yīng)分子，使機體產(chǎn)生對外界刺激的應(yīng)答［2］。MAPKs包括4個亞家族：細胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK和大絲裂素活化蛋白激酶1（BMK1）。其中p38 MAPK 能在宿主受到紫外線照射、熱激、高滲透壓、炎癥因子和生長因子等外界刺激時被激活，進而參與炎癥、細胞生長、細胞分化和細胞死亡等多個生理過程［3］。

目前，已報道的p38 MAPK基因包括p38α、

p38β、p38γ、p38δ四種亞型［4，5-8］，其中p38α和p38β幾乎在所有組織都表達，p38γ和p38δ只在肌肉、胰腺、腸和腎等組織中表達［6，7，9］。該家族的所有成員均具有“T-G-Y”結(jié)構(gòu)域［10］，在經(jīng)典的三級級聯(lián)反應(yīng)中，MAPK激酶的激酶（MAPKKK）和MAPK激酶（MAPKK）可以同時磷酸化激活環(huán)“T-G-Y”中的T（蘇氨酸）和Y（酪氨酸），從而活化p38 MAPK［11］，調(diào)控下游基因的表達。哺乳動物中p38 MAPKs 參與了多種炎癥因子，如TNF-α、IL-6和IL-2的誘導(dǎo)表達，與機體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)［12-15］；此外，病毒感染也能激活哺乳動物p38 MAPKs，如柯薩奇病毒B3型（coxsackievirus B3）的感染能激活機體p38，從而可抑制p38的磷酸化并能夠減少病毒誘導(dǎo)的細胞死亡以及病毒粒子的釋放［16］；而在2型豬圓環(huán)病毒（PCV2）的感染中，抑制p38 MAPK的激活能降低病毒誘導(dǎo)的Caspase活性［17］。以上結(jié)果表明哺乳動物的p38 MAPK在宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

目前，魚類p38 MAPK僅在斑馬魚［18］、大西洋鮭［19］和點帶石斑魚［20］等少數(shù)物種中有報道。紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）是我國南方重要的海水養(yǎng)殖魚類，但近年來由于養(yǎng)殖密度的提高與養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，紅笛鯛養(yǎng)殖中病害頻發(fā)［21］。鑒于魚類p38 MAPK在免疫調(diào)控及抵御病原侵染發(fā)揮著重要的作用［19，20，22-24］，且目前學(xué)術(shù)界尚未見紅笛鯛p38 MAPK的相關(guān)研究報道，本研究通過同源克隆與RACE-PCR擴增得到了紅笛鯛p38β cDNA全長序列（Ls-p38β），并成功獲得了體外表達的重組蛋白，為后續(xù)該基因的功能研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚（500 g左右）購于湛江市東風(fēng)市場；克隆載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、PrimeSTARTMHS（Premix）、Reverse Transcriptase M-MLV 購自Ta-KaRa公司；SMARTerTMRACE試劑盒購自CLONTECH；DNA膠回收試劑盒購自Thermo公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Xho I、T4 DNA連接酶購自NEB公司；PCR引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；Eschericia coli DH5α和 BL21（DE3）菌株、原核表達載體pET-32a（+）Vector由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 無菌操作取紅笛鯛脾臟組織10-20 mg，加入1 mL Trizol，研磨處理，按的UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（上海生工）說明書提取紅笛鯛脾臟組織的總RNA。

1.2.2 片段擴增 利用所得到的mRNA，按照Ta-KaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV說明書進行cDNA第一鏈的合成，根據(jù)已報道的人類（NP_0-02742）、小家鼠（NP_035291）、斑馬魚（NP_001002095）和點帶石斑魚（JN408833）p38β基因設(shè)計簡并引物p38-F和p38-R（表1），以上述cDNA為模板，在下列緩沖體系中：模板1 μL，引物p38-F、p38-R各1 μL，Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Ex Taq 0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。按照如下程序進行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共34個循環(huán)，72℃延伸10 min。電泳檢測PCR產(chǎn)物，將目的條帶切膠回收，回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，挑取單菌落，利用菌落PCR鑒定，將陽性克隆送到上海生工測序。

1.2.3 RACE PCR擴增p38β的全長 根據(jù)所得基因片段，設(shè)計3'RACE特異性引物3'-1、3'-2和5'RACE特異性反向引物5'-1、5'-2（表1），RACE PCR模板的制備參照CLONTECH的SMARTerTMRACE試劑盒說明書。利用3'/5' cDNA一鏈，特異引物3'-1/5'-1和UPM Mix進行第一輪PCR擴增，反應(yīng)體系如下：3'/5' cDNA一鏈 1 μL，UPM Mix 1 μL，3'-1/5'-1 1 μL，Primer Star Mix 10 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，72℃ 2 min，4個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 1 min 4個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min，24個循環(huán)；72℃延伸10 min 。將第一輪的PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，進行巢式PCR，反應(yīng)體系如下：模板1 μL，引物3'-2、5'-2各1 μL，LA Taq buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，LA Taq 0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃1 min，34個循環(huán)，72℃延伸10 min。3'巢式

PCR產(chǎn)物的切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定，測序同1.2.2。

表1 本試驗所用引物

1.2.4 序列分析 測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件拼接得到的cDNA序列在NCBI上進行同源比對和相似性分析；利用NCBI的ORF finder確定ORF，利用Genetyx 7.0翻譯得到氨基酸序列；利用Clustal X 2.0進行氨基酸多重序列比對；利用Clustal X 2.0和MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒 根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計p38β基因的開放閱讀框的引物。在引物的5'和3'端分別加上EcoR I和Xho I酶切位點。擴增紅笛鯛p38β的ORF，所得PCR產(chǎn)物切膠回收后與T載體連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆鑒定方法同1.2.2。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pMD18-p38β，根據(jù)全式金公司的EasyPure Plasmid MiniPrep Kit說明書提取pET-32a以及pMD18-p38β質(zhì)粒。利用EcoR I和Xho I分別對其進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，其余步驟同1.2.2。將測序正確的克隆命名為pET-p38β，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細胞，陽性克隆鑒定同1.2.2。

1.2.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 陽性克隆菌液接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（Amp+），37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，次日按1∶100接種到新的LB培養(yǎng)基（Amp+）中，37℃培養(yǎng)至OD值為0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，6 h后離心收集沉淀，用PBS重懸菌體，置于冰上進行超聲破碎，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

1.2.7 Western blot分析 使用Bio-Rad公司的蛋白印跡裝置將pET-p38β蛋白的電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用6-His-Tag單克隆抗體作為一抗，37℃孵育2 h；TBST清洗4次，每次10 min；HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG作二抗，孵育2 h，TBST清洗4次，每次10 min；加入DAB顯色液至有清晰的目的條帶出現(xiàn)，用ddH2O終止反應(yīng)，并沖洗10 min以終止顯色，拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 紅笛鯛p38β基因的克隆

紅笛鯛p38β基因cDNA序列全長1 628 bp，包括 5'UTR 108 bp、3'UTR 434 bp和 ORF 1 086 bp，可編碼361個氨基酸（圖1），預(yù)測蛋白分子量41.6 kD。

2.2 序列分析

氨基酸的比對結(jié)果（圖2）顯示Ls-p38β的氨基酸序列與尼羅羅非魚（O.niloticus）、斑馬魚（D.rerio）、青鳉（O.latipes）、點帶石斑魚（E.coioides）、紅鰭東方鲀（T.rubripes）高度同源（圖3），其中與尼羅羅非魚的氨基酸序列相似度高達97%。

2.3 原核表達

SDS-PAGE電泳（圖4）表明，重組質(zhì)粒pET32-p38β在大腸桿菌BL21中表達，表達的融合蛋白分子量約60 kD，和理論值相符。Western blot檢測結(jié)果和SDS-PAGE電泳結(jié)果一致。

3 討論

p38 MAPK是一類真核生物中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在多種生理及病理過程中扮演著重要角色。目前p38MAPK的功能研究主要集中在大西洋鮭［19］和點帶石斑魚［20］中，在其他魚類的研究中還相對較少。本試驗克隆得到了紅笛鯛p38β MAPK基因（Ls-p38β），氨基酸序列比對結(jié)果顯示，Ls-p38β與其他魚類的p38β相似度較高，進化分析顯示Lsp38β與其他魚類的p38β聚為一枝，與哺乳類p38β蛋白進化距離較遠，表明魚類p38β具有高度保守性。

圖1 紅笛鯛p38β基因cDNA全長及編碼的氨基酸序列

氨基酸序列分析表明Ls-p38β具有該家族保守的“T-G-Y”結(jié)構(gòu)域和“ATRW”底物結(jié)合位點。兩者在p38 MAPK的磷酸化以及與底物的相互作用中都具有重要作用。“T-G-Y”三肽序列存在于蛋白激酶第Ⅶ和第Ⅷ結(jié)構(gòu)域之間，該區(qū)域被稱作T環(huán)（L12環(huán)狀結(jié)構(gòu)），由于T環(huán)最接近激活位點，是決定MAPK激酶活性的關(guān)鍵部分，T環(huán)的長度會影響其底物的特異性和自主磷酸化作用［25］。研究表明，哺乳動物p38β的T環(huán)結(jié)構(gòu)較短，使得Y（酪氨酸）位點難以被磷酸化。經(jīng)典的MKK途徑通過同時磷酸化活化環(huán)上的蘇氨酸和酪氨酸位點而激活人類p38信號，但是p38活化還存在非經(jīng)典的激活方式。2005年，Salvador等［26］發(fā)現(xiàn)，在活化的人類T細胞中，ZAP-70磷酸化p38α和p38β的Tyr323以后，引起Thr180和Tyr182發(fā)生自身磷酸化，從而導(dǎo)致p38信號被激活。近年來越來越多的研究表明，p38 MAPK在炎癥反應(yīng)和細胞因子表達的調(diào)控中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用［27］，姜勇和Chen等［28-31］通過p38 MAPK無活性突變體以及負顯性突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)哺乳類p38 MAPK發(fā)揮生物功能依賴于“T-G-Y”結(jié)構(gòu)域和Thr180、Tyr182位點。2011年，Ulli等［32］通過研究大西洋鮭的p38α的結(jié)構(gòu)及其新的功能域交換的二聚活化模式，發(fā)現(xiàn)Tyr323的磷酸化及二聚化能夠活化p38α信號，揭示魚類p38 MAPK的激活能夠通過一種非經(jīng)典的磷酸化傳導(dǎo)構(gòu)象來完成。而本研究中紅笛鯛p38β MAPK是否也具備相似的特征還有待于進一步的研究。而在本研究中鑒定的紅笛鯛p38β MAPK也含有p38 MAPK家族保守的功能結(jié)構(gòu)

域“T-G-Y”，但是其作用模式及作用機制尚不清楚，今后我們將通過定點突變、RNA干擾等技術(shù)進一步去驗證，為闡明魚類p38 MAPK的作用機制提供理論依據(jù)。

圖2 紅笛鯛p38β與其他物種p38β氨基酸序列比對結(jié)果

圖3 紅笛鯛p38β的進化分析

圖4 pET32-p38β重組蛋白的純化與免疫印跡檢測

pET載體是目前應(yīng)用最廣泛的原核表達系統(tǒng)，pET-32a作為宿主菌，能夠特異性地識別T7啟動子，并且該載體含有His-Tag標(biāo)簽，便于蛋白的分離純化。劉召民等［33］利用文昌魚的p38重組蛋白制備的（Amphi-p38）抗體進行了免疫組化試驗，發(fā)現(xiàn)Amphi-p38在體表皮、腸和肛盲囊都有強烈的表達信號，這些組織和外界環(huán)境直接接觸，是文昌魚抵御病原侵入的第一道防線，推測文昌魚的p38可能參與了機體的免疫防御過程。本試驗通過構(gòu)建原核表達載體pET32-p38β，成功獲得了體外重組蛋白。以上研究為進一步了解Ls-p38β在細胞中的分布和功能奠定了堅實的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從紅笛鯛脾臟組織中克隆得到p38β基因；Ls-p38β具有保守的“T-G-Y”結(jié)構(gòu)域和“ATRW”底物結(jié)合位點，和其他已報道的p38β基因高度同源；構(gòu)建了原核表達載體pET32-p38β，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過誘導(dǎo)表達獲得了大小約60 kD的p38β重組蛋白。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of p38β MAPK from Lutjanus sanguineus

Xia Hongli1，2，3Cai Jia1，2，3Lu Yishan1，2，3Jian Jichang1，2，3Wu Zaohe2，3，4
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquantic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Key Laboratory of Control for Disease of Aquatic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Humphead snapper（Lutjanus sanguineus）p38β MAPK（Ls-p38β）was cloned using RACE method. The GenBank accession number is KJ502277. The full-length cDNA of p38β MAPK was 1 628 bp containing an open reading frame of 1 086 bp, encoding 361 amino acids with an estimated molecular weight of 41.6 kD and a theoretical pI of 5.74. Amino acid alignment indicated that Ls-p38β possessed a Thr-Gly-Tyr（TGY）dual phosphorylation motif of p38 MAPK family and shared 97% similarity with Oreochromis niloticus p38β. The prokaryotic expression vector pET-p38β was constructed and then transformed into BL21（DE3）. SDS-PAGE and Western blotting analysis indicated that the recombinant protein of Ls-p38β was successfully expressed and molecular weight of expressed fusion protein was 60 kD.

Lutjanus sanguineus p38β MAPK Prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.030

2014-03-27

廣東省國際合作項目（2012B050600029），廣東高校國際合作創(chuàng)新平臺項目（2013gjhz0008）

夏洪麗，女，碩士，研究方向：水產(chǎn)動物病害防治；E-mail：xiahongli0427@163.com

魯義善，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)動物免疫學(xué)及病害防治；E-mail：fishdis@163.com