卵母細胞裂解液逆轉化體細胞為多能干細胞的研究進展

沈心怡 宋坤 楊利珊 肖雄 張大鵬 楊波 李躍民

（重慶市牧草與草食家畜重點實驗室 西南大學動物科技學院，重慶 400715）

卵母細胞裂解液逆轉化體細胞為多能干細胞的研究進展

沈心怡 宋坤 楊利珊 肖雄 張大鵬 楊波 李躍民

（重慶市牧草與草食家畜重點實驗室 西南大學動物科技學院，重慶 400715）

采用卵母細胞裂解液重編程體細胞為多能干細胞是體細胞重編程的一個新思路，該方法主要是通過體細胞與卵母細胞裂解液的共孵育，使得體細胞在形態、基因和功能等方面發生改變，趨向于胚胎干細胞的方向發展。就卵母細胞裂解液重編程體細胞的研究現狀、影響因素及存在的問題進行綜述。

卵母細胞 卵母細胞裂解液 重編程 體細胞 多能干細胞

胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有自我分裂增殖并且能夠人工誘導分化成為機體內各種類型細胞的潛能，由于其獨特的生物學特性，使得ESCs被廣泛應用于生物學的眾多研究領域。但是，為了避免毀損人類胚胎導致的倫理問題，近年來，對干細胞的研究熱點轉向了誘導性多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）領域，即通過體細胞重編程途徑獲得iPSCs。目前，用于體細胞重編程的方法主要有卵核移植、細胞融合、限定因子誘導和細胞抽提物誘導等。本文根據卵母細胞核移植的原理，對卵母細胞裂解液重編程體細胞的研究現狀、相關機理以及現存問題進行綜述。

1 卵母細胞裂解液重編程體細胞為多能干細胞的研究現狀

細胞抽提物誘導法是將已分化的體細胞置于具有多潛能類型細胞（如卵母細胞、ESCs［1］、畸胎瘤細胞［2］）的抽提物中，通過其提供的能夠誘發細胞核發生重編程的調控元件［2］，誘導體細胞發生重編程，最終獲得iPSCs。Gurdon［3］采用體細胞核移植技術成功獲得幼蛙；1997年，英國羅斯林研究所宣布利用成年母綿羊乳房上皮細胞為供核細胞進行核移植得到了體細胞克隆羊 “Dolly”［4］。2011年，吳蘇君等［5］將牛成纖維細胞移植入生發泡期（Germinal vesicle stage，GV期）和MII期卵母細胞的細胞質以

后，經過培養其重組核移植卵的轉錄因子Nanog和Oct 4基因均被誘導表達，并且明顯定位于所移植的成纖維細胞的細胞核上，而成纖維細胞組和未注射成纖維細胞的空白卵母細胞組中均未檢測到Nanog和Oct 4的表達。試驗表明移入體細胞核的卵母細胞具有誘導已分化體細胞發生重編程的能力，在卵母細胞質內的胞漿物質中含有特定的轉錄因子能夠使移入的體細胞核表達Nanog和Oct 4類蛋白質活性物質。當采用液氮反復凍融的方法裂解卵母細胞并富集其有活性的胞漿物質后，細胞內參與重編程的一些關鍵蛋白和細胞因子、轉錄調控因子等能夠被人為地富集起來，有利于對體細胞進行體外轉化誘導，當與經鏈球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）通透化處理過的體細胞共孵育時，這些物質就有可能進入體細胞內發生作用，促使其發生內源性染色體結構重建、DNA甲基化、組蛋白乙?；?、印跡基因表達和維持多能性必需基因的活化等重編程過程，將已成熟分化的體細胞逆轉化為多能干細胞的狀態。與其他誘導法相比，卵母細胞裂解液誘導法還具有以下優勢：（1）不存在被導入的ESCs（或多能性細胞）的染色體重編程；（2）利用卵母細胞裂解液可以將體細胞直接重編程、去分化為多能干細胞，而不用回歸到胚胎狀態，簡化了重編程的方法，縮短了重編程的時間，同時，卵母細胞裂解液中多種成分的共同作用，為實現高效重編程奠定了基礎；（3）通過操縱細胞提取物的成分有望識別與重編程有關的細胞因子，有利于闡明重編程的機制。

近年來，已有研究人員利用干細胞裂解液成功地將體細胞重編程為多能干細胞。McGann等［6］將C2C12起源的小鼠肌小管連續培養在蠑螈新生肢細胞提取物中發現，有18%的細胞發生去分化，成為可以進行DNA復制的成肌細胞，去除細胞提取物后，去分化細胞的表型依然存在，表明已經發生了細胞的重編程；2004年，Hansis等［7］報道爪蟾屬卵母細胞提取物可以誘導293T細胞和白細胞發生重編程形成細胞團，這些細胞團外形上與ESCs形成的細胞克隆相似，可以表達Oct 4，而且堿性磷酸酶陽性；2005年，Taranger等［2］發現未分化的人類畸胎癌細胞——NCCTT可以重編程293T細胞成為具有多能性的未分化的細胞團。在NCCTT提取物中處理一周后，60%-70%的細胞顯示出核內Oct 4蛋白標志；2010年，Han等［1］將人成纖維細胞培養在人類ESCs抽提物、5-氮-2-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine，5-Aza-dC）和曲古抑菌素（Trichostatin A，TSA）和維A酸的混合液中，形成了人類ESCs集落。

2 影響卵母細胞裂解液重編程體細胞效率的因素

2.1 卵母細胞的細胞周期

用于制備裂解液的卵母細胞所處減數分裂階段的不同，體細胞重編程的效率存在差異。一般用作裂解液的卵母細胞為GV期和MII期卵母細胞。GV期卵母細胞中有線粒體ATP8基因的表達［8］。且GV期卵母細胞的核很大，染色質高度疏松，外包完整的核膜，此時的細胞核又稱為GV［9］。哺乳動物卵母細胞MII期的維持與高水平的成熟促進因子（Mature promoting factor，MPF）活性有關，而MPF的活性則是由對Ca2+非常敏感的細胞靜止因子（Cytostatic factor，CSF）所維持，MII期卵母細胞不斷地合成CSF，使CSF一直處于高水平［10］，并且MII期卵母細胞中含有多種母源蛋白［11］。這兩個不同時期的卵母細胞所含有的轉錄因子都可能對逆轉化過程起到一定作用，但對移入細胞核的分裂形式表現不同。

Kwon等［12］采用GV期豬卵母細胞提取物（GVcyto）處理成纖維細胞，結果發現成纖維細胞的形態發生了變化，處理7 d形成小集落，培養3周后集落擴大，類似ESCs的集落形態，并且伴有Oct 4、Nanog蛋白的微弱表達和其他多能性標志物的變化，而未經GVcyto處理過的成纖維細胞沒有顯示任何形態變化或蛋白標志物的表達，表明GV期卵母細胞中存在重編程所需的必要的調控元件。Miyamoto等［13］分別用豬GV期和MⅡ卵母細胞抽提物評估誘導體細胞重編程的能力，前者誘導激活多能性標志基因的表達，細胞呈克隆樣生長；后者重編程作用引起基因組H3K9去乙?；?、TATA盒結合蛋白（TATA box binding protein，TBP）消失，但沒有明顯的形態學變化，說明GV期和MⅡ期卵母細胞都具有誘導體細胞重編程的能力。因此，卵母細胞（GV期和MII期）裂解液中必定含有某些重編程作用因子，

可誘導體細胞的重編程。

2.2 體細胞的種類

由于成纖維細胞具有體內儲量豐富、取材方便且易于分離培養等優勢，保證了充足的實驗材料，常被用于體細胞重編程的研究。除了成纖維細胞外，已有研究表明，在特定的轉錄因子誘導下，角質形成細胞比成纖維細胞更容易去分化為多能干細胞［14］，因為角質形成細胞中含有對上皮細胞具有比較強的促使分裂原活性的一種生長因子——角質細胞生長因子，其對組織損傷具有明顯的促進修復和保護作用。在卵母細胞裂解液中角質形成細胞是否能替代甚至優于成纖維細胞還有待進一步研究。

2.3 卵母細胞裂解方法

細胞提取物的制備方法很關鍵，目前主要有以下4種：（1）液氮反復凍融法：將收集到的細胞經液氮反復凍融后，離心收集細胞裂解液的懸浮液作為細胞提取液，可保存在-80℃的超低溫冰箱內［15］；（2）超聲波處理法：采用直徑2 mm的探針進行超聲波脈沖破碎細胞，離心收集細胞裂解液，用液氮速凍后保存在-80℃的超低溫冰箱內［16］；（3）高速離心法：使用固定角轉頭的高速離心機對細胞進行4℃、90 000 r/min離心破碎，細胞提取物轉移到新的離心管后再離心一次，從而收取細胞提取液［13］；（4）玻璃吸管吹打法：采用口徑在細胞和細胞核大小之間的顯微吸管反復吹打細胞使其破碎，而細胞核沒有破碎，此方法僅限于個體大的細胞，如卵母細胞和胚胎細胞［17］。

2.4 被誘導體細胞膜的通透性處理

SLO是膽固醇依賴性溶血素家族中的一員，是由溶血家族A鏈球菌分泌得到的單鏈聚合水溶性蛋白質。在適宜濃度下，SLO可以與細胞膜上的膽固醇聚合成由非共價鍵形成的弧形或環形的膜通道，而大部分細胞膜可保持完整。正是因為形成這樣的膜通道，細胞提取物才得以進入到體細胞中。目前，比較成熟的方法是首先采用細菌毒素SLO穿透供體細胞的質膜，然后將供體細胞置于靶細胞的細胞提取物中共孵育，靶細胞特異性因子擴散入已被穿透的供體細胞，并被供體細胞的細胞核占據。細胞提取物進入到體細胞后，加入適宜濃度的CaCl2可以重新封閉膜通道，保持細胞膜的通透性。通過后續培養，分析細胞功能特征的改變，可以測定其重編程的效率。近年來，研究人員發現了可以替代SLO對細胞進行滲透化處理的物質——洋地黃皂苷（Digitonin）。洋地黃皂苷是一種非離子去污劑，可以與細胞膜膽固醇絡合［18］。洋地黃皂苷只滲透化處理含高膽固醇的細胞膜部位，不會與細胞核膜發生反應，幾乎不影響細胞骨架的完整性［19］。在2004年，Hansis等［20］研究發現，用洋地黃皂苷進行通透化處理的293T細胞與細胞提取物共培養后也可表達Oct 4基因；2012年，Yang等［21］研究發現15 μg/mL的洋地黃皂苷比10 μg/mL去甲基化的效果更好。

2.5 被誘導體細胞核內染色質結構的激活處理

研究發現，多能性相關的基因啟動子DNA在體細胞中處于高度甲基化和低乙酰化狀態，不具備發生轉錄的條件，而在干細胞中卻是處于低甲基化和高乙?；癄顟B，有利于多能性相關基因的表達。2010年，Han等［1］研究發現，在人成纖維細胞與干細胞的細胞抽提物共培養之前，添加5-AzadC 和TSA處理成纖維細胞可以提高體細胞重編程的逆轉化效率。5-Aza-dC是甲基轉移酶抑制劑，在DNA復制過程中，可以與DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）結合形成一種共價復合物，抑制該酶的甲基轉移活性，而達到去甲基化的目的。TSA是乙酰化酶抑制劑，其通過抑制去乙?；傅幕钚詠硖岣呓M蛋白的乙酰化程度。TSA 可以廣泛地改變表觀遺傳狀態，激活基因表達，包括外源基因，不具有顯著的特異性。

3 問題及應用前景

3.1 關于重編程的效率問題

卵母細胞裂解液的濃度和SLO的濃度的確定是影響體細胞重編程效率的關鍵因素，卵母細胞裂解液能夠將成纖維細胞重編程為多能干細胞，但是沒有確切的轉化率報道。有文獻報道細胞抽提物重編程的最高有效率為90%［22］，但是，由于在后期培養過程中不斷地更換培養液，造成了重編程細胞的流失，以致無法獲得準確的比例［23］。因此，需要進一步研究如何提高重編程效率和提出簡單有效的計數方法。另外，對于卵母細胞裂解液重編程的作用機

理尚不明確，對裂解液中存在的有效成分也不了解，從而影響了重編程體系的穩定性。未來通過操縱細胞提取物的成分有望識別與重編程有關的細胞因子，有利于闡明重編程的機制，提高重編程的效率。

3.2 關于重編程所得多能干細胞的安全性問題

iPSCs是一種有望替代ESCs的一類細胞群，具有和ESCs類似的功能，而且繞開了人類ESCs研究一直面臨的倫理和法律等方面的問題，基于以上兩點，iPSCs成為了近年來干細胞研究的熱點。但是，令人擔憂的是，誘導所得多能干細胞存在著安全隱患。研究發現應用體細胞重編程的方法在體外誘導體細胞逆轉化所得多能干細胞，具有較高的畸變率和癌變率。由于卵母細胞裂解液中所含有的重編程物質種類齊全、濃度高、含量豐富，在富集濃縮情況下對體細胞的重編程誘導作用應該表現得更加完全，所誘導出現的iPSCs更具有生理性，因此，采用卵母細胞裂解液重編程體細胞的方法，有望提高其安全性，成為今后研究的重點。

綜上所述，采用卵母細胞裂解液重編程體細胞為多能干細胞的方法具有許多優勢，如卵母細胞裂解液的制備過程較為簡單、所得裂解液可以保存使用、重編程效率較高、所得iPSCs更具有生理性、可以有效避免毀損胚胎帶來的倫理問題、用于卵母細胞來源動物或人時能夠降低免疫排斥反應、改善克隆性治療安全性。因此，卵母細胞裂解液介導體細胞重編程的方法在再生醫學、藥物篩選、疾病模型及其發育生物學等方面具有重要的研究意義和廣闊的應用前景。

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（責任編輯 狄艷紅）

Progress on Oocytes Extracts-mediated Derivation of Pluripotent Stem Cells from Somatic Cells

Shen Xinyi Song Kun Yang Lishan Xiao Xiong Zhang Dapeng Yang Bo Li Yuemin
（Chongqing Key Lab of Forage & Herbivore，College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400715）

Oocytes extracts-mediated derivation of pluripotent stem cells from somatic cells provides a new way for reprogramming. Morphologies, genes, and functions of somatic cells will be changed and somatic cells tend to be reprogrammed into stem cells after in-vitro coincubation with oocytes extracts. The present situation, influence factors, existing problems, and prospects of somatic cells reprogramming using oocytes extracts were described in this review.

Oocytes Oocytes extracts Reprogramming Somatic cells Pluripotent stem cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.004

2014-03-22

國家級大學生創新創業訓練計劃（201210635016）

沈心怡，女，碩士研究生，研究方向：臨床獸醫學；E-mail：564169219@qq.com

李躍民，男，教授，研究方向：動物胚胎工程； E-mail: lymswu@126.com