核酸免疫制備鼠抗棉鈴蟲FK506結合蛋白的多克隆抗體

朱燕 張富春 馬紀 黃麗娜 劉小寧

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

核酸免疫制備鼠抗棉鈴蟲FK506結合蛋白的多克隆抗體

朱燕 張富春 馬紀 黃麗娜 劉小寧

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

利用電注射基因導入法制備小鼠抗棉鈴蟲FK506結合蛋白（FKBP12）的多克隆抗體，并通過Western blot驗證抗體與抗原的特異性結合。構建重組質粒pcDNA3-FKBP12并測序驗證序列的正確性，利用基因導入法將重組質粒pcDNA3-FKBP12注射到小鼠體內，免疫4次后用ELISA檢測法確定抗體的效價，并對抗體的特異性結合進行Western blot以及免疫組化檢測。結果表明，小鼠抗FK506結合蛋白血清的效價達到1∶25 600，Western blot結果顯示此抗血清能與融合蛋白His-FKBP12結合，免疫組化結果表明在棉鈴蟲3齡幼蟲不同組織中FKBP12均有表達。說明電注射基因導入法制備的小鼠抗FK506結合蛋白的抗體在滴度和特異性結合方面都達到預期要求。

棉鈴蟲 FK506結合蛋白 多克隆抗體

FKBP在動、植物的各種細胞中均有分布，含量豐富，大小從12-135 kD不等［1］。除了肽基脯氨酰基異構酶活性（PPIase）外，很多FKBPs還參與其他一些生理生化活動，如基因轉錄（FKBP25和FKBP38）、 內 質 網 蛋 白 分 泌（FKBP13和FKBP65）［2］、膜結合表皮生長因子受體（TGFβR）介導的信號調節（FKBP12）［1］、細胞內Ca2+釋放（FKBP12）及甾體激素受體復合物的形成（FKBP52）等［3］。

FKBP12是FKBPs家族中的一種重要的胞漿蛋白，到目前為止在哺乳動物中發現FKBP12的兩種亞型分別命名為FKBP12和FKBP12.6，這兩個FKBP12都有108個氨基酸組成，分子量分別是11.95 kD和11.78 kD。而本實驗組研究的棉鈴蟲

FK506結合蛋白，分子量在11.88 kD，已有研究表明，棉鈴蟲FKBP12參與棉鈴蟲滯育，20-羥基蛻皮激素能夠誘導發育，解除滯育，而FKBP12與20-羥基蛻皮激素（20E）的作用相反，參與維持滯育的過程［4］，而在其它昆蟲中還未見相關報道。

棉鈴蟲（Helicoverpa amigera）是一種世界性的農業和經濟作物害蟲，棉鈴蟲表現出對多種殺蟲劑的抗性，且能夠不斷對新的殺蟲劑產生抗藥性［5］，導致棉鈴蟲爆發成災，造成農作物減產。為有效控制棉鈴蟲抗藥性，減少棉鈴蟲對農作物的危害，本實驗組欲從基因表達調控水平闡述棉鈴蟲產生抗性的機理，以期在基因表達水平阻斷棉鈴蟲產生抗藥性。已有研究證實CYP6B6家族基因的表達與植物次生物質的代謝調節有密切關系［6］，前期本實驗組用一定濃度植物次生物質2-十三烷酮處理棉鈴蟲，構建了cDNA文庫，經酵母單雜交篩選得到FK506結合蛋白的基因全長。在此基礎上，本研究構建pcDNA3-FKBP12重組質粒，免疫昆明小鼠制備抗體，經Western blot驗證抗體能與純化的融合蛋白His-FKBP12特異性結合［7］，對3齡幼蟲免疫組化，使抗體與棉鈴蟲不同組織中天然的FKBP12結合，旨在為深入探究FKBP12在棉鈴蟲體內的表達奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與質粒 pcDNA3質粒為本實驗室保存，為真核表達載體；昆明白小鼠購買于新疆醫科大第一附屬醫院。

1.1.2 試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、各種限制性內切核酸酶均為大連TaKaRa公司產品，蛋白質相對分子質量標準物來自Thermo Scientific公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG購自中衫金橋公司，大腸桿菌DH5α菌株感受態細胞購買于北京全式金公司，醋酸纖維素膜是Millipore公司產品，ELISA板購自ET BIOFIL公司，DNA回收試劑盒購自上海生工生物公司，DAB顯色試劑盒購自康為世紀，其余所用的化學試劑均為國產分析純試劑。基因導入儀來自上海塔瑞莎健康科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pcDNA3-FKBP12的構建和大量提取 根據前期篩選得到的FKBP12全長序列，設計FKBP12（327 bp）的PCR引物（表1），并用此引物擴增得到FKBP12全長序列。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產物和pcDNA3質粒，酶切產物經切膠回收后，將目的片段與載體片段連接并轉化DH5α，挑取單克隆進行酶切鑒定后，將鑒定正確的單克隆送至華大基因測序。測序結果經序列比對正確后大量提取pcDNA3-FKBP12質粒，并檢測質粒濃度和純度。

表1 擴增FKBP12的引物

1.2.2 小鼠抗FKBP12抗體的制備 取5只昆明小白鼠，用苦味酸對老鼠進行染色標記，依次把在右前腿部、右后腿部、頭部、背部、尾部染色的小鼠記為1-5號小鼠，用TERASA基因導入儀制備FKBP12抗血清。在免疫前取小鼠血清作為陰性血清對照，并用生理鹽水稀釋重組質粒pcDNA3-FKBP12，使質粒的終濃度達到1 μg/μL，免疫部位為小鼠右后腿肌肉組織，先注射20 μL，濃度為1 μg/μL的pcDNA3-FKBP12質粒，而后在同一注射部位給予一定的電流刺激（電壓設置60 V，脈沖頻率1 Hz，脈沖次數6次），幫助質粒進入小鼠肌肉組織內部。每隔7 d免疫1次，共免疫4次，每次免疫后對小鼠進行眼眶采血法收集血清。

1.2.3 ELISA檢測小鼠抗FKBP12抗體效價 用濃度為10 μg/mL融合蛋白His-FKBP12于4℃過夜包被ELISA板，次日用PBST緩沖液洗滌3次，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h。再用PBST緩沖液洗滌3次后加入不同稀釋濃度的小鼠血清，37℃孵育1 h。洗滌后以1∶2 000的稀釋比例加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。PBST洗3次后加TMB底物顯色，避光顯色15 min后，加入2 mol/L的硫酸終止反應，用酶標儀檢測A450/A655。未免疫前的血清為對照，其A450/A655值為N；免疫后

的A450/A655值為P，以P/N＞2.1判斷為陽性。

1.2.4 Western blot檢測FKBP12抗體與抗原特異性結合 Western blot檢測參照Bio-Rad公司的實驗指導手冊，將未經IPTG誘導的轉入pET32a-FKBP12重組質粒的BL21菌的總蛋白、經鎳柱純化的His-FKBP12融合蛋白進行15%的SDS-PAGE電泳，之后采用Mini-PROTEAN 3 Trans-Blot系統（伯樂）轉移至醋酸纖維素膜上，經過小鼠抗FKBP12血清和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG孵育后加DAB顯色5 min，顯色結果用掃描儀進行掃描。

1.2.5 免疫組織化學染色法檢測FKBP12在棉鈴蟲體內的表達特征 ①固定：將3齡幼蟲在40 g/L多聚甲醛固定液中固定12 h后制作石蠟切片，切片厚度為4-6 μm。②撈片：石蠟切片撈至經多聚賴氨酸（Sigma Diagnostics）預處理的載玻片上，常規脫蠟至水；③抗原熱修復：將PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）置于微波爐，中高火加熱至沸騰后，再將組織切片浸入其中并調至低火使保持沸騰狀態加熱20 min；④0.3 g/L的過氧化氫溶液作用30 min以封閉內源性過氧化物酶；⑤封閉：PBS洗后（5 min×3次），0.5 g/L正常山羊血清封閉切片30 min（減少非特異性結合）；⑥孵育一抗（鼠抗FKBP12多克隆抗體，1∶1 00），4℃過夜，PBS清洗（5 min×3次）；⑦孵育二抗（辣根過氧化物酶標記標記的山羊抗鼠，1∶1 000），室溫孵育2 h，PBS清洗（5 min×3次）；⑧DAB顯色30 s-5 min（但每張切片顯色時間保持一致）；⑨脫水，中性樹膠封片。置于光鏡下觀察并拍照。陰性對照用免前陰性血清替代一抗，其它步驟同上。

2 結果

2.1 重組質粒pcDNA3-FKBP12的構建

用BamH I和Xho I雙酶切原始FKBP12（327 bp）的PCR產物和pcDNA3質粒，得到的酶切片段進行連接并轉化DH5α。挑取單克隆進行酶切鑒定的結果（圖1）顯示，挑取1-5號單克隆進行菌液PCR均為陽性克隆，從中選取3號提取質粒并雙酶切鑒定，酶切出約330 bp的目的條帶（圖2），表明FKBP12已連接至pcDNA3載體上，重組質粒pcDNA3-FKBP12可用于后續試驗。

圖1 重組質粒pcDNA3-FKBP12的菌液PCR鑒定

圖2 重組質粒pcDNA3-FKBP12雙酶切鑒定

2.2 重組質粒pcDNA3-FKBP12的序列比對和大量提取

將酶切鑒定正確的DH5α-pcDNA3-FKBP12的3號菌株送至華大基因測序，測序結果與原始FKBP12序列進行比對，在核酸水平上有4個堿基突變（圖3-A），氨基酸序列完全一致（圖3-B），重組質粒pcDNA3-FKBP12產生的FKBP12抗體不會改變FKBP12的抗原表位，因此可以大量提取重組質粒pcDNA3-FKBP12，用于免疫小鼠。

2.3 ELISA檢測小鼠抗FKBP12抗體的效價

在質粒pcDNA3-FKBP12單獨免疫4次后，用ELISA測定5只不同小鼠的血清效價（圖4）。5只小鼠抗血清ELISA檢測的A450/655值與陰性對照相比均大于2.1，1-5號小鼠分別為4.0、3.2、3.6、3.4和3.66，由圖4可知，4次基因免疫后5只小鼠的血清效價均達到1∶25 600，說明5只小鼠的抗體滴度均達到預期目標，可滿足后續試驗需求。

2.4 免疫組織化學染色法檢測多克隆抗體的特異性結合

用陰性血清和第4次免疫后的抗血清進行融合蛋白His-FKBP12的Western blot檢測，結果（圖5）

顯示，在抗血清和二抗稀釋的比例為1∶2 000和1∶10 000時，小鼠抗FKBP12血清與His-FKBP12融合蛋白在33 kD處雜交顯示出條帶，而陰性血清與His-FKBP12融合蛋白雜交在33 kD處沒有條帶，說明4免后的FKBP12抗血清能夠與His-FKBP12融合蛋白特異性結合。綜上，用基因導入儀免疫小鼠制備的棉鈴蟲FKBP506抗血清能夠與His-FKBP12融合蛋白特異性的結合。在此基礎上，用免疫組織化學染色法檢測棉鈴蟲體內天然FKBP12表達情況，結果（圖6）顯示小鼠抗FKBP12血清能與棉鈴蟲3齡幼蟲不同組織的FKBP12特異結合，而陰性血清卻無此特性，說明核酸免疫制備小鼠抗棉鈴蟲FKBP12血清能與天然FKBP12特異結合，為深入探究FKBP12在棉鈴蟲體內的表達奠定基礎。

圖3 重組質粒pcDNA3-FKBP12的測序比對結果

3 討論

已有大量研究結果表明，FK506是一類免疫抑制劑，參與免疫抑制，而抑制IL-2的產生是FK506免疫抑制的主要機制。FKBP12是免疫抑制劑FK506的胞內受體蛋白，能參與多種生理作用，如對T細胞激活的抑制作用，參與細胞周期的調控［1］。FK506-FKBP實現免疫抑制作用，主要是通過在鈣調神經磷酸化酶（CaN）誘導下，使得活化的T細胞核因子（NF-AT）的去磷酸化，從而阻礙NF-AT向核內遷移，阻斷白介素-2的分泌實現免疫抑制作用［7］。FK506結合蛋白與信號轉導密切相關，參與細胞周期、細胞生長發育、細胞存活和凋亡以及基因轉錄等多種細胞生命活動。FK506可通過與FKBP的結合，抑制mTOR信號通路的傳導，從而影響

細胞蛋白質合成、細胞運動及代謝、細胞凋亡等過程［8］。棉鈴蟲要經過4次完全變態發育（歷卵、幼蟲、蛹和成蟲），這些完全變態發育過程受到大量細胞信號轉導事件的精確調控，而這些細胞信號轉導事件目前還沒有研究清楚。2010年，朱佳等［4］經研究發現在棉鈴蟲滯育蛹中FKBP12在mRNA和蛋白水平都有較高表達，FKBP12參與了棉鈴蟲滯育過程。而在棉鈴蟲滯育過程中TOR基因表達量較低，推測FKBP12抑制TOR基因的表達，進而維持滯育，這說明FKBP12能夠響應外界不良環境，參與調控棉鈴蟲的生長發育，因此推測FKBP12可能參與CYP6B6的解毒代謝通路，或者參與棉鈴蟲應對外界不利環境的調控。

圖4 ELISA檢測質粒pcDNA3-FKBP12免疫小鼠4次后的血清效價

圖5 多克隆抗體與融合蛋白His-FKBP12的特異性結合的檢測

圖6 多克隆抗體與棉鈴蟲體內天然FKBP12特異性結合的檢測

本實驗小組構建重組質粒pcDNA3-FKBP12，經測序比對，發現測序結果在4處出現堿基突變，但翻譯成氨基酸的序列并沒有發生改變，因此重組質粒pcDNA3-FKBP12構建成功，用此重組質粒對5只昆明小鼠進行質粒電注射基因免疫，每隔一周免疫一次，獲得了棉鈴蟲FKBP12的鼠抗血清，用前期純化的His-FKBP12融合蛋白作為抗原，經ELISA試驗驗證免疫4次后抗體效價，效價達到1∶25 600，但5只小鼠產生的抗體還是存在著個體差異，其中3號小鼠抗體效價最高，這可能與小鼠體重生長狀態有關，經觀察3號小鼠個頭較小，在免疫期間體重變化較小，四免時體重變化較大的2號小鼠，其產生的抗體效價相對較低，這可能是影響抗體效價的一個重要原因，因此為避免這類情況，在免疫小鼠制備抗體時可選擇相對穩定的BALB/c小鼠。Western blot檢測結果表明，此血清能靈敏且特異性地與純化的融合蛋白His-FKBP12結合，經免疫組織化學染色法檢測棉鈴蟲體內FKBP12的表達情況，結果表明制備的抗FKBP12抗血清能與天然的FKBP12特異結合，說明FKBP12在3齡幼蟲不同組織中均有表達。綜上，制備的鼠抗FKBP12多克隆抗體可用來檢測FKBP12在棉鈴蟲體內的時空表達規律及其應對外界不利因素影響下的表達情況，為詮釋棉鈴蟲細胞色素P450 CYP6B6的誘導表達與植物次生物質之間關系奠定基礎。

4 結論

用核酸免疫制備了小鼠抗棉鈴蟲FKBP12的多

克隆抗體，用ELISA檢測抗體效價高達1∶25 600，用Western blot 和免疫組織學染色法驗證了該多克隆抗體能與棉鈴蟲天然蛋白能特異性結合。

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（責任編輯 馬鑫）

Preparation of the Polyclonal Antibody Against Helicoverpa armigera FK506 Binding Protein by Immunizing with pcDNA3-FK506BP

Zhu Yan Zhang Fuchun Ma Ji Huang Li’na Liu Xiaoning
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

It was to prepare the polyclonal antibody against FK506 binding protein, which was to be to verified the specificity of the antibody by Western blot. Firstly, recombinant expression plasmid pcDNA3-FKBP12 was constructed and sequenced, and the recombinant plasmid pcDNA3-FKBP12 was then transfered into Kunming mice four times. Finally, ELISA assay, Western blot analysis and immunohistochemistry（IHC）were used to determine the titer of polyclonal antibody of FK506 binding protein and its specificity, respectively. The results showed that the titer of polyclonal antibody reached 1∶25 600, and it was able to bind specifically to both the fusion protein His-FKBP12 and FKBP12 from the different tissues of the cotton bollworm in the 3rdlarvae, which laid the foundation for the subsequent experiments.

Helicoverpa armigera FK506 binding protein Polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.023

2014-03-31

國家自然科學基金項目（31260444），自治區自然基金項目（2012211A018），公益性行業（農業）科研專項經費項目（200903033）

朱燕，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：1069806808@qq.com

劉小寧，女，博士，研究方向：農業昆蟲與害蟲防治；E-mail：liuxn0103@sina.com