四種鱘魚線粒體PCR-RFLP鑒定方法的研究

董傳舉劉園園劉曉勇宋迎楠徐鵬孫效文

（1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院水產(chǎn)應(yīng)用基因組中心，北京 100141；3. 中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚國家級良種場，北京 100070）

四種鱘魚線粒體PCR-RFLP鑒定方法的研究

董傳舉1，2劉園園2劉曉勇3宋迎楠1，2徐鵬2孫效文2

（1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院水產(chǎn)應(yīng)用基因組中心，北京 100141；3. 中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚國家級良種場，北京 100070）

利用線粒體序列開發(fā)高效準確的分子鑒定方法廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品易混物種的鑒定中。應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)，對鱘魚易混種開展了分子生物學鑒定方法研究。結(jié)果表明，利用一組引物對8種鱘魚線粒體基因進行PCR擴增，分別應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Taqα I、Ava II和Eag I-HF、Nae I對擴增產(chǎn)物進行酶切，并用3.0%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果，可從8種鱘魚易混種中分別鑒別出中華鱘、小體鱘、達氏鰉以及歐鰉。所建立的方法操作簡單，在保證魚種存活基礎(chǔ)上只需剪取少量鰭條，便可快速準確地進行常見鱘魚和不同鱘魚產(chǎn)品的鑒別，大大增加了鑒定結(jié)果的準確性和可信度，極大地提高了工作效率。

鱘魚 線粒體DNA PCR-RFLP 鑒定方法 分子標記

鱘魚（Sturgeon）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）、輻鰭亞綱（Actinopterygii）、硬鱗總目（Ganoidomorpha）、鱘形目（Acipenseriformes），目前全世界共有1目2科7屬27種［1］。中國是世界鱘魚品種最多、分布最廣、資源最為豐富的國家之一［2］，境內(nèi)有2科3屬8種，分別為施氏鱘（Acipenseridae schrenckii）、達氏鰉（Hoho dauricus）、中華鱘（A. sinensis）、達氏鱘（A. dabryanus）、白鱘（Psephurus gladius）、西伯利亞鱘（A. baerii）、小體鱘（A. ruthenus）、裸腹鱘（A. nudiventris），鱘魚是一類古老的軟骨硬鱗魚，有“活化石”之稱［3］。目前，這些古老的鱘魚類均處于不同程度的瀕危狀態(tài)［4］，部分物種甚至有滅絕的危險［5］。鱘魚卵營養(yǎng)豐富，以其卵加工制成的鱘魚籽醬，價格昂貴，是國際公認的奢侈食材，被比作“黑

色黃金”。

隨著我國鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，很多亟待解決的問題也隨之產(chǎn)生。目前許多養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖企業(yè)培育了多達幾十種鱘魚雜交種，這些雜交種在幼體培育、生長、抗逆、懷卵量等方面性狀突出，常常與其純系親本種在外形上極其相似，尤其在受精卵和苗種階段，很難進行辨認和鑒別。而在鱘魚魚子醬的貿(mào)易中，不同種類來源的魚子醬的價格差別極大，因此養(yǎng)殖戶和生產(chǎn)企業(yè)如果不能在苗種早期進行有效的種類鑒定，將承受巨大的經(jīng)濟損失。另外，有些鱘魚種類是《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）［6］附錄明確禁止貿(mào)易的物種，如中華鱘等，故在鱘魚制品貿(mào)易和監(jiān)管中需要有效地將這些瀕危鱘魚物種鑒定和區(qū)分。

目前國際上進行鱘魚種類鑒定主要采用的方法包括形態(tài)學、生物化學和遺傳學等方法。依據(jù)這些方法并不能準確區(qū)分不同的鱘魚，從而造成相互混雜，直接影響育種效果。Congiu等［7，8］使用AFLP分子標記方法進行了鱘魚及魚籽醬產(chǎn)品的鑒別應(yīng)用，Chelomina等［9］使用RAPD分子標記進行了施氏鱘自然種群中雜交種的鑒別分析。目前以線粒體為材料來研究鱘魚類進化關(guān)系的研究報道相對也較多，主要集中在線粒體D-Loop序列部分、細胞色素b、12S rRNA、16S rRNA等區(qū)域［10］。對線粒體D-Loop的研究發(fā)現(xiàn)，多種鱘魚mtDNA均存在異質(zhì)現(xiàn)象［11，12］。近年來國內(nèi)外常用線粒體D-Loop以及微衛(wèi)星DNA標記開展鱘魚的分子鑒定［13，14］。這些技術(shù)手段盡管能夠不同程度地對鱘魚及其產(chǎn)品進行相對精確的鑒定，但也存在技術(shù)操作繁瑣、鑒定時間長、設(shè)備昂貴等缺點，且對操作人員技術(shù)要求較高。故亟須開發(fā)高效、快速、準確的鱘魚種質(zhì)鑒定技術(shù)，用于鱘魚育種，物種保護以及鱘魚產(chǎn)品的檢測。

本研究通過線粒體序列的比對分析，旨在利用鱘魚純種資源，發(fā)掘各種鱘魚的特異突變標簽，開發(fā)基于PCR-RFLP技術(shù)的快速種質(zhì)鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗種質(zhì) 本研究利用中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚國家級良種場保存的鱘魚種質(zhì)資源——中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘各10尾活體，剪取尾鰭少許放入1.5 μL離心管中，-30℃ 保存。

1.1.2 儀器與試劑 限制性內(nèi)切酶和PCR試劑均購置于NEB（北京）有限公司，引物由生工生物公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR儀為Applied Biosystem9902。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取上述中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘鰭條約0.5 g，剪碎，放入1.5 mL離心管中分別編號并應(yīng)用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，并把同一物種的DNA等量混勻，分別編號1-8。

1.2.2 線粒體DNA的PCR擴增 使用美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）水產(chǎn)品分子條形碼鑒定通用引物［15］擴增上述基因組DNA（表1）。PCR擴增反應(yīng)體系為15 μL：加入0.1 μL濃度為2 500 U/mL的Taq DNA聚合酶，1.5 μL 10×PCR緩沖液，1.5 μL濃度為10 pmol/μL的dNTPs，1.2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL所述基因組DNA，濃度為10 pmol/μL的上下游引物各0.5 μL和7.7 μL無菌水。

PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 PCR擴增引物

1.2.3 線粒體序列的獲取與序列比對分析、差異內(nèi)切酶位點選取 把上述擴增得到的片段，送往中美泰和（北京）生物公司，進行序列測定。收集各片段序列，在軟件MEGA5.1中進行序列比對分析。通過比對分析找出各個物種之間不同的差異，從而選取不同的內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶的酶切

1.2.4.1 Taqα I酶切反應(yīng) 在8個200 μL PCR反應(yīng)管中，分別加入上述8種PCR產(chǎn)物1 μL，2 μL

10×buffer酶切緩沖液，0.2 μL 100×BSA，0.5 μL限制性內(nèi)切酶Taqα I，加無菌水至20 μL，所述酶切反應(yīng)體系在65℃溫育反應(yīng)1 h，80℃熱失活20 min，其中10×酶切緩沖液pH值為7.5，成分為100 pmol/μL Tris-HCl，50 pmol/μL NaCl，10 pmol/μL MgCl2，0.025% Triton?×-100。

1.2.4.2 Ava II和Eag I-HF酶切反應(yīng) 在8個200 μL PCR反應(yīng)管，分別加入上述8種PCR產(chǎn)物1 μL，2 μL 10×buffer酶切緩沖液，0.2 μL 100×BSA和0.5 μL限制性內(nèi)切酶Ava II，加無菌水至20 μL，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37℃溫育反應(yīng)1 h，65℃熱失活20 min；然后再取200 μL PCR反應(yīng)管，加入1 μL所述PCR產(chǎn)物，2 μL 10×buffer酶切緩沖液，0.2 μL 100×BSA和0.5 μL限制性內(nèi)切酶Eag I-HF，加無菌水至20 μL，然后將所述酶切反應(yīng)體系在37℃溫育反應(yīng)15 min，65℃熱失活20 min。其中10×酶切緩沖液pH值為7.5，成分為100 pmol/μL Tris-HCl，50 pmol/μL NaCl，10 pmol/μL MgCl2，0.025% Triton?×-100。

1.2.4.3 Nae I酶切反應(yīng) 在200 μL PCR反應(yīng)管中，加入上述1 μL上述產(chǎn)物，2 μL 10×buffer酶切緩沖液，0.2 μL 100×BSA，0.5 μL限制性內(nèi)切酶Nae I，加無菌水至20 μL，所述酶切反應(yīng)體系在37℃溫育反應(yīng)1 h，65℃熱失活20 min。其中10×酶切緩沖液pH值為7.5，成分為100 pmol/μL Tris-HCl，50 pmol/μL NaCl，10 pmol/μL MgCl2，0.025% Triton?×-100。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產(chǎn)物及所有酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為3.0%。電泳結(jié)束后，用凝膠圖像處理系統(tǒng)采集電泳圖，收集數(shù)據(jù)，計算片段大小。同時把酶切后得到的片段送往中美泰和（北京）生物公司進行序列測定，驗證分析結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘、俄羅斯鱘線粒體DNA均擴增出單一的片段，未發(fā)現(xiàn)其片段長度多態(tài)性，測序得到片段大小均為666 bp（圖1）。經(jīng)過序列分析，確定位于mtDNA COXI區(qū)域。

圖1 線粒體DNA的PCR產(chǎn)物

2.2 序列比對結(jié)果

2.2.1 Taqα I酶切位點比對 應(yīng)用MEGA5.1軟件對中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘進行序列比對。在中華鱘擴增產(chǎn)物中距多核苷酸序列5'端的第586和587位堿基之間的磷酸二酯鍵為限制性內(nèi)切酶Taqα I酶切位點（TCGA），施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘均無該酶切位點（圖2）。故可通過限制性內(nèi)切酶Taqα I對上述擴增片段進行酶切，鑒定出中華鱘。

2.2.2 Ava II及Eag I-HF酶切位點比對 應(yīng)用MEGA5.1軟件對中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘進行序列比對，發(fā)現(xiàn)中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘中，距上述PCR產(chǎn)物多核苷酸序列5'端的第196和197位堿基之間的磷酸二酯鍵為限制性內(nèi)切酶Ava II的酶切位點（GGWCC），小體鱘和達氏鰉無該酶切位點；在酶切區(qū)分出小體鱘和達氏鰉的基礎(chǔ)上，距中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐鰉、閃光鱘、俄羅斯鱘和達氏鰉上述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'端第522和523位堿基之間的磷酸二酯鍵為限制性內(nèi)切酶Eag I-HF酶切位點（CGGCCG），小體鱘無該酶切位點（圖2）。所以可以通過限制性內(nèi)切酶Ava II和限制性內(nèi)切酶Eag I-HF對上述擴增片段進行酶切，故可鑒定出小體鱘和達氏鰉。

2.2.3 Nae I酶切位點比對 應(yīng)用MEGA5.1軟件對中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘進行序列比對，在中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘所述PCR產(chǎn)物中距多核苷酸序列5'端的第316和317位堿基之間的磷酸二酯鍵為限制性內(nèi)切

酶Nae I的酶切位點（GCCGGC），歐鰉無該酶切位點（圖2）。故可通過限制性內(nèi)切酶Nae I對上述擴增片段進行酶切，從而鑒定出歐鰉。

2.3 酶切結(jié)果

2.3.1 內(nèi)切酶Taqα I酶切 內(nèi)切酶Taqα I酶切結(jié)果，見圖3。

圖2 序列比對結(jié)果及酶切位點

圖3 內(nèi)切酶TaqαI的酶切結(jié)果

圖4 內(nèi)切酶Ava II的酶切結(jié)果

2.3.2 內(nèi)切酶Ava II和內(nèi)切酶Eag I-HF的酶切 內(nèi)切酶Ava II和內(nèi)切酶Eag I-HF的酶切結(jié)果，見圖4和圖5。

2.3.3 內(nèi)切酶Nae I的酶切 內(nèi)切酶Nae I的酶切結(jié)果，見圖6。

2.4 結(jié)果分析

2.4.1 中華鱘的鑒定 在中華鱘的PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'的第586和587位堿基之間的磷酸二酯鍵為Taqα I的酶切位點，故經(jīng)Taqα I酶切后產(chǎn)生了特異的兩條帶，而施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、

達氏鰉、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘無所述酶切位點，所以酶切后電泳結(jié)果中只有一條帶，從中鑒定出中華鱘。酶切后片段大小見表2。

圖5 內(nèi)切酶Eag I-HF的酶切結(jié)果

圖6 內(nèi)切酶Nae I的酶切結(jié)果

表2 八種鱘魚的PCR-RFLP片段大小

2.4.2 小體鱘和達氏鰉的鑒定 在中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘上述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'端的第196和197位堿基之間的磷酸二酯鍵均為Ava II的酶切位點，小體鱘和達氏鰉沒有所述酶切位點，所以Ava II酶切后小體鱘和達氏鰉只有一條帶，從而把小體鱘和達氏鱘分離出來；在中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、歐鰉、閃光鱘、俄羅斯鱘和達氏鰉上述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'端的第522和523個堿基之間的磷酸二酯鍵為Eag I-HF酶切位點，酶切后均產(chǎn)生了特異的兩條帶，小體鱘無所述酶切位點，酶切后只有一條帶，故可以鑒定出小體鱘。所以通過Ava II和Eag I-HF可以鑒定出小體鱘和達氏鱘，酶切后片段大小見表2。

2.4.3 歐鰉的鑒定 在中華鱘、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、達氏鰉、閃光鱘和俄羅斯鱘上述PCR產(chǎn)物中多核苷酸序列5'端的第350和351位堿基之間的磷酸二酯鍵為Nae I酶切位點，故Nae I酶切后，產(chǎn)生特異的兩條帶；歐鰉沒有所述酶切位點，故酶切后仍只有一條帶，所以可以鑒定出歐鰉，酶切后片段大小見表2。

3 討論

線粒體DNA（mtDNA）作為真核細胞的核外遺傳因子，結(jié)構(gòu)十分簡單。脊椎動物的線粒體基因大小約16 kb，結(jié)構(gòu)基本相同［16］：1個mtDNA控制區(qū)（D-Loop區(qū)），13個蛋白質(zhì)基因，22個tRNA基因。共價雙鏈閉環(huán)分子具有自主復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力［17］，并且復制方式簡單，結(jié)構(gòu)基因緊湊，無間隔序列和內(nèi)含子，進化速率是核基因的5-10倍，且缺少有效的DNA損傷修復機制，還有突變累加效應(yīng)［18］?；蚱未笮∵m中，種間進化速率較快，對于探索物種系統(tǒng)發(fā)育極為有效［19］。mtDNA序列的差異可以表明遺傳群體在進化過程中的分離，單倍型頻率可以揭示地理種群間的轉(zhuǎn)移［20］。由于線粒體DNA的這些特點，mtDNA序列也越來越多地用于研究馴養(yǎng)動物的親緣關(guān)系、起源及其多樣性，例如兔子、豬、山羊、水牛、馬等［21-26］。

PCR-RFLP技術(shù)是最早的分子標記之一，指基于限制性內(nèi)切酶消化不同長度的限制片段的多態(tài)現(xiàn)象。該技術(shù)不僅適用于在不同地理群體之間建立分子遺傳標記，從而比較不同地理群體之間的親緣關(guān)系，也可以作為區(qū)分不同地理群的分子遺傳標記［27］。由于擴增總DNA，所以可以有效避免純化mtDNA

的繁瑣步驟并且可以通過PCR方法很好地控制DNA片段大小，酶切位點數(shù)，以及擴大模板量，適用于微量組織樣品的分析，所以在mtDNA分析中也被廣泛使用。由于該技術(shù)結(jié)果可靠、準確、具有較高的穩(wěn)定性，并且檢測中僅需要少量的組織材料，所以適用于對物種各個發(fā)育階段的鑒別研究［28］。

基于線粒體序列開發(fā)高效準確的分子鑒定方法廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品易混物種的鑒定中，如Aoyama等［29］利用mtDNA PCR-RFLP技術(shù)開發(fā)了歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）和亞洲鰻鱺的快速鑒定方法，Karaiskou等［30］利用mtDNA PCR-RFLP技術(shù)對竹莢魚屬3個種成功地進行了分子鑒定等；莊怡等［31］利用PCR-RFLP技術(shù)對鯽魚（Carassius auratus）6個不同品系成功的進行鑒定；王淞等［32］對3個長江野生群體以及一個人工繁殖群體共158尾鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）mtDNA D-Loop區(qū)段進行PCR-RFLP分析從而鑒定4個不同群體的差異；吳海防等［33］采用PCR-RFLP技術(shù)對江西瑞昌、湖南長沙、天津?qū)幒?個群體的144尾草魚（Ctenopharyngodon idellus）DNA D-Loop區(qū)段進行了分析，得出草魚mtDNA D-Loop區(qū)段的遺傳多樣性很低的結(jié)論；文菁等［34］基于570 bp左右的mtDNA 16S rRNA基因片段，利用3種核酸內(nèi)切酶（Dde I，Hae III和Sty I）對16種海參PCR產(chǎn)物進行酶切，分別產(chǎn)生10種、5種和5種單倍型，通過單倍型的組合，即能有效區(qū)分16種海參的種類。董麗娜等［35］對北部灣3 種金線魚屬魚類的mtDNA COI基因序列進行分析，證明了3種金線魚之間的親緣關(guān)系。汪登強等［36］對13種鱘形目魚類mtDNA PCR-RFLP分析的結(jié)論表明，鱘形目魚類存在廣泛變異且鱘科的6種魚與匙吻鱘（Polyodon spathala）和白鱘（Psephurus gladius）分成兩大支；鱘科中兩種鰉魚沒有聚到一起，支持了鰉魚不能作獨立分類單元的觀點。

4 結(jié)論

本研究基于鱘魚線粒體DNA開發(fā)出常見鱘魚種類的PCR-RFLP快速鑒定方法。試驗過程方便快捷易操作，可在較短時間內(nèi)快速準確地鑒定出鱘魚易混種。在不處死魚種的基礎(chǔ)上，剪取少量鰭條，提取待檢測樣本的基因組DNA，通過1對引物擴增出鱘魚mtDNA COXI區(qū)域的部分片段，應(yīng)用不同限制性內(nèi)切酶的酶切作用，即可分別把中華鱘、小體鱘、達氏鱘、歐鰉從其他常見鱘魚類中鑒別出來。通過PCR擴增片段的限制性酶切，得到的限制性酶切圖譜，不但為鱘魚類中的鑒定提供了大量的分子標記，同時也為進一步構(gòu)建物理圖譜、進化遺傳學和育種研究打下了基礎(chǔ)；也有利于實際生產(chǎn)部門，科研部門快速鑒定所取樣本，增加了鑒定結(jié)果的準確性和可信度，極大提高了工作效率。

［1］Froese R, Pauly D. FishBase. 2011. World Wide Web electronic publication. http：//www.fishbase.org（accessed 2012-02-20）.

［2］楊玲, 趙燕, 魯亮, 等.鱘魚魚皮膠原蛋白的提取及其理化性能分析［J］.食品科學, 2013, 34（23）：41-46.

［3］William E, Bemis, Kynard B. Sturgeon rivers：An introduction to acipenseriform biogeography and life history［J］. Environment Biology of Fishes, 2002, 17（2）：167-183.

［4］李融.中國鱘魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究［D］.青島：中國海洋大學, 2008.

［5］Vadim JB, William EB, John RW. The threatened status of acipenseriform species：a summary［J］. Environment Biology of Fishes, 2002, 17（3）：427-435.

［6］瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約［G］.北京：中華人民共和國瀕危物種進出口管理辦公室, 2010, 9.

［7］Congiu L, Dupanloup I, Patarnello T, et al. Identification of interspecific hybrids by amplified fragment length polymorphism：the case of sturgeon［J］. Mol Ecol, 2001, 10（9）： 2355-2359.

［8］Congiu L, Fontana L, Patarnello T, et al. The use of AFLP in sturgeon identification［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2002, 18（4-6）：286-289.

［9］Chelomina G, Rozhkovan K, Ivanov S. Discrimination of interspecific hybrids in natural populations of Amursturgeon fish by means of multilocus RAPD-PCR markers［J］. Cytology and Genetics, 2008, 42（5）：342-350.

［10］孔杰, 關(guān)梅, 周洲, 等.分子標記在鱘魚研究中的應(yīng)用［J］.農(nóng)技服務(wù), 2013, 30（7）：775-776.

［11］Buroker NE, Brown JR, Gilbert TA, et al. Length heteroplasmy of sturgeon mitochondrial DNA：an illegitimate elongationmodel［J］. Genetics, 1990, 124（1）：157-163.

［12］Miracle AL, Campton DE. Tandem repeat sequence variation and length heteroplasmy in the mitochondrial DNA D-loop of the threatened Gulf of Mexico sturgeon, Acipenser oxyrhynchus desotoi［J］. Journal of Heredity, 1995, 86（1）：22-27.

［13］Pourkazemi M, Skibinski D, Beardmore J. Application of mtDNA d-loop region for the study of Russian sturgeon population structure from Iranian coastline of the Caspian Sea［J］. Journal of Applied Ichthyology, 1999, 15（4-5）：23-28.

［14］Zhu B, Zhou F, Cao H, et al. Analysis of genetic variation in the Chinese sturgeon, Acipenser sinensis：estimating the contribution of artificially produced larvae in a wild population［J］. Journal of Applied Ichthyology, 2002, 18（4-6）：301-306.

［15］Handy SM, Deeds JR, Jonathan R, et al. A single laboratory validated method for the generation of DNA barcodes for the identification of fish for regulatory compliance［J］. Association of Official Analytical Chemists, 2011, 94（1）：201-210.

［16］Miya M, Kawagchi A, Nishida M. Mitogenomic exploration of higher teleostean phylogenies：a case study formoderatescale evolutionary genomics with 38 newly determined complete mitochondrial DNA sequences［J］. Molecular Biology And Evolution, 2001, 18（11）：1993-2009.

［17］白俊杰, 等.魚類種質(zhì)分子鑒定技術(shù)［M］.北京：海洋出版社, 2011.

［18］陳四明, 吳清江, 張亞平.中華鱘（Acipenser sinensis）及相關(guān)種類的mtDNA控制區(qū)串聯(lián)重復序列及其進化意義［J］.中國生物化學與分子生物學報, 2000, 16（4）：458-461.

［19］Raghava GP, Solanki RJ, Soni V, Agrawal P. Fingerprinting method for phylogenetic classification and indentification of microorganisms based on variation in 16S rRNA gene sequences［J］. Biotechniques, 2000, 29（1）：108-115.

［20］Moritz C. Applications of mitochondrial DNA analysis in conservation：a critical review［J］. Molecular Ecology, 1994, 3（4）：401-411.

［21］Gerold K, Marcelo V, Artur S, et al. Analysisi of mitochondrial D-loop region casts new light on domestic water buffalo（Bubalus bubalis）phylogeny［J］. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2004, 30（2）：308-324.

［22］Kim K, Lee J, Li K, et al. Phylogenetic relationships of Asian and European pig breeds determined by mitochondrial DNA D-loop sequence polymorphism［J］. Anim Genet, 2002, 33（1）：19-25.

［23］Kim K, Yang Y, Lee S, et al. Phylogenetic relationships of Cheju horses to other horse breeds as determined by mtDNA D-loop sequence polymorphism［J］. Animal Genetics, 1999, 30（2）：102-108.

［24］Long JR, Qiu XP, Zeng FT, et al. Origin of the rabbit（Oryctolagus cuniculus）in China：evidence from mitochondrial DNA control region sequence analysis［J］. Anim Genet, 2003, 34（2）：82-87.

［25］Manjunath BJ, Pramod KR, Ajoy KM, et al. Phylogeography and origin of Indian domestic goats［J］. Molecular Biology and Evolution, 2004, 21（3）：454-462.

［26］Wang Z, Jayasankar P, Khoo SK, et al. AFLP fingerprinting reveals genetic variability in common carp stock from Indonesia［J］. Asian Fisheries Science, 2000, 13（2）：139-147.

［27］張林, 吳濤, 何力. 4個不同地理群體中華鱉pomc基因PCRRFLP分析［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2013, 32（5）：106-111.

［28］王強, 劉芳, 赫崇波, 等. 4種海水魚線粒體DNA大片段的PCR- RFLP分析［J］.水產(chǎn)科學, 2006, 25（5）：246-249.

［29］Aoyama J, Nishida M, Watanabe S, et al. Discrimination of catadromous eel species, genus Anguilla, using PCR-RFLP analysis of the mitochondrial 16S rRNA domain［J］. Transactions of the American Fisheries Society, 2000, 129（3）：873-878.

［30］Karaiskou N, Apostolidis AP, Triantafy llidis A, et al. Genetic identification and phylogeny of three species of the genus Trachurus based on mitochondrial DNA analysis［J］. Marine Biotechnology, 2003, 5（5）：493-504.

［31］莊怡, 劉必謙, 唐杰.利用PCR-RFLP技術(shù)對鯽魚6個不同品系的鑒定［J］.生物技術(shù)通報, 2012（11）：144-149.

［32］王淞, 曹曉霞, 谷口順彥, 董仕. 4個群體鰱mtDNA D-loop的PCR-RFLP分析［J］.淡水漁業(yè), 2010, 40（4）：4-9.

［33］吳海防, 董仕, 單淇, 谷口順彥. 3個群體草魚mtDNA D-Loop的PCR-RFLP分析［J］.水產(chǎn)科學, 2006, 25（4）：184-188.

［34］文菁, 胡超群, 張呂平, 等. 16種商品海參16S rRNA的PCRRFLP鑒定方法［J］.中國水產(chǎn)科學, 2011, 18（2）：451-457.

［35］董麗娜, 黃梓榮, 等.北部灣3種金線魚屬魚類COI基因序列的比較分析［J］.中國水產(chǎn)科學, 2011, 18（3）：508-514.

［36］汪登強, 危起偉, 王朝明, 等. 13種鱘形目魚類線粒體DNA的PCR-RFLP分析［J］.中國水產(chǎn)科學, 2005, 12（4）：383-389.

（責任編輯 馬鑫）

PCR-RFLP Analysis of mtDNA to Identify Four Kinds of Sturgeons

Dong Chuanju1，2Liu Yuanyuan2Liu Xiaoyong3Song Yingnan1，2Xu Peng2Sun Xiaowen2
（1. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Centre for Applied Aquatic Genomics，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；3. National Sturgeon Hatchery，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100070）

With the high efficient and accurate, molecular identification methods are widely used in some easily confused species. So we carried out the research in some miscible species of sturgeons with the application of PCR-RFLP. With the help of one pair primers, we amplified one region of mtDNA in 8 kinds of sturgeons’ which contain Acipenseridae sinensis, A. schrenckii, A. baeri, A. ruthenus, Huso dauricus, H. huso, A. stellatus, A. gueldenstaeti. When digested with the restriction enzyme of Taqα I, Ava II, Eag I-HF and Nae I then test the results of PCR and enzyme digestion reactions with the density 3.0% of agarose gel, A. sinensis, A. ruthenus, H. dauricus, H. huso can be identified from other sturgeons. This method just need one pair of primers which is specific for binding to the mitochondrial DNA to amplify genomic DNA, then digested the products of PCR with different enzymes. So it is convenient to operate and can identify the species accurately in a relatively short period of time. On the basis of a little fin, we can identify common sturgeon species credibility and accuracy and also greatly improved the work efficiency.

Sturgeon mtDNA PCR-RFLP Identification method Molecular marker

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.013

2014-05-12

國家“863”計劃項目（2011AA100401），農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項項目（200903045）

董傳舉，男，博士研究生，研究方向：水產(chǎn)基因組學；E-mail：cjd1989@126.com

徐鵬，研究員，研究方向：水產(chǎn)基因組學；E-mail：xupeng@cafs.ac.cn