納豆脂肽對人乳腺癌細胞MCF-7的作用

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(北京聯合大學應用文理學院,生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191)

乳腺癌作為最常見的惡性腫瘤,發病率居高不下。2012年美國A Cancer Journal for Clinicians公布的數據顯示,預計2022年美國乳腺癌患病率為41%,與宮頸癌(8%)、大腸癌(8%)相比,排名女性惡性腫瘤發病率第一位[1],在我國乳腺癌的患病率也比較高[2]。近年來,乳腺癌在治療方面取得了很大的進展,但其易轉移、愈后易復發以及耐藥性的特點仍是治療乳腺癌的關鍵問題。納豆是用納豆芽孢桿菌發酵大豆制成的食品,與未發酵大豆相比,納豆中的大豆甙元和染料木素含量是發酵前的數十倍,而且在發酵過程中還產生降血脂、溶血栓作用的納豆激酶[3]以及具有良好表面活性的納豆脂肽[4]。目前國內外對納豆脂肽的研究多集中于表面活性劑[4-7]、抗真菌[8-9]和抗細菌[10-13]方面,對其抗腫瘤[14]活性研究的較少。本論文從納豆發酵液中提取純化得到納豆脂肽,研究其對人乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌 由本實驗室從納豆發酵液中提取;人乳腺癌細胞株MCF-7 北京中醫藥大學;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM/F12培養基、0.25% EDTA-胰酶 美國Gbico;MTT(溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑)、DMSO 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 南京凱基生物有限公司;細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;其它試劑均為國產分析純。

HZQ-X100恒溫震蕩培養箱 太倉市實驗設備廠;GI54DWS高壓滅菌鍋 美國ZEALWAY;5804R高速離心機 德國eppendorf;DMI6000B活細胞工作站 德國Leica;SG603A-HE-INT生物安全柜 美國BAKER公司;FACSCalibur流式細胞儀 美國BD Biasciences。

表1 納豆脂肽對MCF-7細胞增殖的影響Table1 Effect of natto lipopetide on the cell proliferation of MCF-7

1.2 納豆脂肽的提取和純化

1.2.1 培養基的配制 培養基配制參考曹小紅[11]的文獻。配制好的培養基,121℃下滅菌20min。

1.2.2 納豆芽孢桿菌的培養 納豆芽孢桿菌活化2～3次后,接種于種子液培養基,35℃,140r/min搖床培養24h。將種子液以5%的接種量接種于發酵培養基,35℃,140r/min搖床培養48h。

1.2.3 納豆脂肽的提取純化 脂肽提取純化方法參考呂應年[15]的文獻。發酵液4℃,10000r/min,離心10min,收集上清液用濃鹽酸調pH2.0,4℃靜置后離心收集沉淀。加適量NaOH使沉淀溶解,再加活性炭吸附,離心取上清液,真空旋轉蒸發得褐色固體。所得固體用二氯甲烷索式抽提12h后旋轉蒸發去掉二氯甲烷,得納豆脂肽粗提物,記為N1。

將粗品N1溶于適量丙酮中,浸提過夜后超聲3h,4℃,10000r/min,離心20min得上清液,真空旋轉蒸發去掉上清液,所得固體即為納豆脂肽,記為N2。

取少量N1和N2溶于二氯甲烷,點樣于薄層硅膠板,在氯仿∶乙酸=8∶2(V/V)的展開劑中展開,噴水顯色。

1.3 納豆脂肽誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡的作用

1.3.1 MCF-7的培養與傳代 將MCF-7培養在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中,置于37℃、5% CO2培養箱中培養,待細胞鋪滿80%時,胰酶消化,按1∶3的比例傳代。

1.3.2 納豆脂肽對MCF-7的體外增殖抑制實驗 采用MTT法測定納豆脂肽對MCF-7體外增殖的抑制情況。取對數生長期的MCF-7細胞2×104個/mL接種于96孔培養板上。設置不同濃度的實驗組(0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL)和空白對照組,各組設6個平行孔。細胞貼壁后加入不同濃度的脂肽,培養12h。然后每孔加MTT溶液20μL,繼續培養4h。小心吸取上清,加150μL DMSO,吹打均勻,在波長570nm處用酶標儀測定各孔吸光度值,計算抑制率(IR)和半數致死濃度(IC50)。其中抑制率的計算公式為:

1.3.3 納豆脂肽對MCF-7細胞凋亡和周期的影響 取對數生長期的MCF-7細胞1×105個/mL接種于6孔培養板上。細胞貼壁后加入不同濃度的脂肽(0、1、2、4μg/mL),繼續培養12h。參照AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒的說明書,流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期。

1.4 統計學分析

采用SPSS12.0統計學軟件,單因素方差分析,p<0.05表示有顯著性差異,p<0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 納豆脂肽的分離純化

提取純化后,N1、N2的得率分別是0.029g/L和0.021g/L。其薄層結果見圖1。

圖1 納豆脂肽的薄層分析 Fig.1 TLC analysis of the natto lipopeptide

2.2 納豆脂肽對MCF-7存活率的影響

表1表明,納豆脂肽濃度為0.25、0.5μg/mL時,對MCF-7存活率的影響不顯著。當濃度為1、2、4、8μg/mL時,對MCF-7存活率的影響顯著(p<0.05),且呈一定的劑量效應關系,12h的IC50是3.68μg/mL。

2.3 納豆脂肽對MCF-7細胞形態的影響

圖2為不同濃度納豆脂肽作用MCF-7細胞12h后的細胞形態。正常細胞呈不規則梭形,隨著納豆脂肽濃度的增大,細胞數量不斷減少且形態上逐漸皺縮變為圓形。

圖2 納豆脂肽作用MCF-7細胞后的細胞形態(×200) Fig.2 Cell morphology of MCF-7 after being treated with natto lipopeptide(×200)

2.4 納豆脂肽對MCF-7細胞凋亡率的影響

表2表明,納豆脂肽濃度為1、2、4μg/mL時,與空白對照組(0.32%)相比,MCF-7細胞的凋亡率顯著升高,分別為8.47%、9.47%和31.04%(p<0.05),且呈一定的劑量效應關系。

表2 納豆脂肽作用MCF-7細胞后的凋亡率Table 2 Apoptosis rate of MCF-7 after being treated with natto

2.5 納豆脂肽對MCF-7細胞周期的影響

表3表明,納豆脂肽(0、1、2、4μg/mL)作用MCF-7細胞12h后細胞周期分布發生明顯改變:G0/G1期細胞所占百分比從68.17%下將至47.98%;S期細胞所占百分從19.72%上升至41.04%,表明納豆脂肽可以在將細胞周期阻滯在S期。

表3 納豆脂肽作用MCF-7細胞后的 細胞周期分布Table 3 Cell cycle distribution of MCF-7 after being treated with natto

3 討論

納豆中含有的脂肽類物質主要有surfactin、Iturin、Fengycin。其中surfactin由一個七肽和β-羥基脂肪酸組成,其作用機理可能是surfactin嵌入到磷脂雙分子層中,改變靶細胞的細胞膜通透性和脂肪酸組成,造成脂膜的破壞[16-17],進而誘導癌細胞的凋亡[18-19]。乳腺癌作為發病率較高的惡性腫瘤,嚴重威脅女性的健康,因此開發研究抗乳腺癌藥物在預防和治療乳腺癌方面具有重要的意義。但是目前國內外對脂肽在抑制乳腺癌方面的研究較少,曹小紅等人[20]發現surfactin可以抑制人乳腺癌細胞MCF-7的增殖,作用MCF-7細胞24h后的IC50是27.3μmol/L。本次實驗研究證實納豆脂肽對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖有抑制作用,并呈一定的劑量效應關系,且12h后的IC50是3.68μg/mL。通過活細胞工作站鏡檢和流式細胞儀測細胞凋亡和細胞周期,證實納豆脂肽可使細胞形態發生改變,誘導MCF-7細胞凋亡,并將細胞周期阻滯在S期,其誘導MCF-7細胞凋亡的機理將在后續的實驗中繼續研究。

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