人參皂苷Rb1對過氧化氫誘導的B16F10鼠黑素瘤細胞凋亡的保護作用

劉海平高 華付洪軍

人參皂苷Rb1對過氧化氫誘導的B16F10鼠黑素瘤細胞凋亡的保護作用

劉海平1高 華2付洪軍3

目的: 確定人參皂苷Rb1對過氧化氫誘導的B16F10黑素瘤細胞凋亡的保護作用。方法:將B16F10細胞隨機分為對照組，H2O2組和Rb1＋H2O2組(細胞培養液中分別加入10 mg/L、20 mg/L、50mg/L的人參皂苷Rb1和H2O2)。分別測定B16F10細胞活力、LDH漏出量、線粒體膜電位及細胞凋亡水平。結果: H2O2作用24 h后，B16F10細胞活力降低至對照組的53.77%，而Annexin V和PI陽性細胞比例為25.6%，顯著高于對照組(P＜0.01)。50 mg/L人參皂苷Rb1預處理后，B16F10細胞活力為對照組的77.75%，較H2O2組增加44.6%(P＜0.01)。Annexin V和PI陽性細胞比例為14.4%，明顯低于H2O2組(P＜0.01)，并且LDH漏出率明顯降低，線粒體膜電位顯著升高。結論: 人參皂苷Rb1對H2O2所致的B16F10黑素瘤細胞凋亡具有保護作用，有效提高其抗氧化應激能力。

人參皂苷Rb1； B16F10細胞； 凋亡

白癜風是一種獲得性、進行性色素脫失性疾病，其發病機制尚未完全闡明，但越來越多的證據表明，氧化應激可能是白癜風黑素細胞缺失的重要原因。過氧化氫(H2O2)是機體氧化代謝的產物，也是一類活性氧自由基(ROS)。1Schallreuter等2研究發現，進展期白癜風患者表皮內H2O2水平升高。體外研究也表明，H2O2能使黑素細胞樹突回縮，形態改變，抑制黑素細胞增殖和色素合成，故推測H2O2為主的氧化劑在黑素細胞環節對白癜風的發病起重要作用。3人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)內含有能夠清除自由基的抗氧化物質，不僅可以直接清除氧自由基，也可以通過增強胞漿內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－PX)及過氧化氫酶(CAT)的活性間接清除氧自由基。4本實驗以H2O2損傷B16F10鼠黑素瘤細胞造成氧化應激損傷模型，觀察人參皂苷Rb1對黑素瘤細胞的保護作用，并從細胞活力和細胞凋亡等方面闡明其作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司，人參皂苷Rb1購于南京廣潤生物制品有限公司，四氮唑藍(MTT)和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC－1)購自Sigma公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Annexin V＆PI凋亡檢測試劑盒購自Calbiochem公司。B16F10鼠黑素瘤細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗分組 常規培養的B16F10細胞隨機分組:①對照組，細胞培養液不加任何處理因素，37℃培養24 h；②H2O2組，細胞培養液中加入終濃度為100μM的H2O2，37℃培養24 h；③Rb1＋H2O2組，將培養的B16F10細胞中分別加入10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的人參皂苷Rb1預處理6 h后，細胞培養液中加入終濃度100μM的H2O2，37℃培養24 h。

1.3 檢測及方法

1.3.1 MTT法測定B16F10細胞活力 各組細胞接種于96孔板，細胞密度為1×104cells/孔，每組8孔，每孔加MTT溶液10μL(5 g/L)，37℃孵育4 h；棄上清，每孔加入100μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物完全溶解。于波長570 nm處測各孔吸光度(A)值，各組細胞活力以占對照組百分比表示。

1.3.2 LDH漏出量測定 收集各組細胞，離心、取上清，按說明書以分光光度計比色法測定細胞培養上清LDH漏出量。

1.3.3 JC－1線粒體功能檢測 收集各組細胞(2× 105cells/組)，用預溫(37℃)的完全培養基調整至1 mL。細胞懸液加入JC－1儲存液(1 mg/mL)2.5μL，振蕩細胞懸液直至標本形成均一的紅紫色；37℃避光保存10 min。加入2 m L PBS至細胞懸液中，2000 r/ min室溫離心5 min，去上清；以0.3 mL PBS重懸細胞，流式細胞儀分析。用發紅色熒光細胞百分率(JC－1＋%)表示線粒體膜電位正常細胞的比例。

1.3.4 Annexin V＆PI法檢測細胞凋亡 收集各組細胞(3×105cells/組)，用PBS洗滌2次(2000 r/min離心5 min)，棄上清；加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞；細胞懸液中加入5μL Annexin V－FITC混勻后，然后加入5μL PI混勻；室溫、避光、反應5～15 min，流式細胞儀檢測。

1.4 統計學方法 所有實驗數據采用SPSS 11.5統計軟件進行單因素方差分析，以均數±標準差表示，P＜0.05為有統計學意義。統計圖采用SigmaPlot8.0軟件制作。

2 結果

2.1 人參皂苷Rb1對H2O2所致B16F10細胞活力的影響 見圖1。MTT結果顯示:H2O2組B16F10鼠黑素瘤細胞活力為對照組細胞活力的(53.77±5.54)%，顯著低于對照組(P＜0.01)；10 mg/L Rb1＋H2O2組和20 mg/L Rb1＋H2O2組細胞活力分別為對照組細胞活力的(56.74±2.96)%、(61.61±3.48)%，與H2O2組比較無顯著差異(P＝0.255和P＝0.097)；50mg/L Rb1＋H2O2組細胞活力為對照組細胞活力的(77.75± 4.41)%，較H2O2組增加44.6%(P＜0.01)。

圖1 人參皂苷Rb1對B16F10細胞活力的影響

2.2 人參皂苷Rb1對H2O2所致B16F10細胞LDH漏出量的影響 見表1。與對照組相比，H2O2組LDH漏出量明顯增加(P＜0.01)；與H2O2組相比，50 mg/LRb1＋H2O2組LDH漏出量顯著降低(P＜0.01)；而10mg/L Rb1＋H2O2組和20 mg/L Rb1＋H2O2組LDH漏出量無明顯降低(P＝0.173和P＝0.085)。

2.3 人參皂苷Rb1對H2O2所致B16F10細胞線粒體膜電位的影響 見表1。H2O2處理后，B16F10細胞線粒體膜電位較對照組顯著降低(P＜0.01)；10 mg/L和20 mg/L Rb1預處理后，線粒體膜電位與H2O2組無顯著差異(P＝0.227和P＝0.075)；而50 mg/L Rb1預處理后線粒體膜電位明顯升高(P＜0.01)。結果提示，50 mg/L人參皂苷Rb1具有保護線粒體，減輕H2O2對細胞線粒體的損傷。

表1 B16F10細胞LDH漏出量和線粒體膜電位(MMP)的變化

2.4 人參皂苷Rb1對H2O2致B16F10細胞凋亡的影響 見圖2。流式結果顯示，對照組Annexin V陽性細胞比例(4.2±1.2)%，Annexin V和PI雙陽性細胞比例(8.1±1.8)%。給予H2O2處理后，凋亡水平明顯增加(P＜0.01)，Annexin V陽性細胞比例(17.3±2.5)%，Annexin V和PI雙陽性細胞比例(25.6±3.7)%。給予人參皂苷Rb1(50mg/L)預處理后，Annexin V陽性細胞比例(9.5±2.6)%，Annexin V和PI雙陽性細胞比例(14.4±4.0)%，統計結果顯示明顯降低了凋亡水平(P＜0.01)。而10 mg/L和20 mg/L人參皂苷Rb1作用無統計學意義(P＝0.437和P＝0.195)。

圖2 人參皂苷Rb1對H2O2致B16F10細胞凋亡的影響

3 討論

H2O2是一種活性氧自由基(ROS)，能自由穿過細胞膜、核膜與金屬離子反應，產生羥自由基，羥自由基可以與嘌呤和嘧啶發生反應，損傷細胞DNA。5，6ROS還能作為細胞內信使激活轉錄因子，通過影響基因轉錄，促使凋亡基因上調，誘導細胞發生凋亡。7目前研究表明，低濃度(小于100μM)H2O2主要導致細胞凋亡，高濃度H2O2主要導致細胞壞死。8本研究結果表明，B16F10黑素瘤細胞在H2O2作用下細胞活力和線粒體膜電位均下降，培養上清中LDH漏出量及細胞凋亡率增加，說明H2O2可通過誘導氧化應激引起黑素瘤細胞的凋亡。

由于氧化應激在白癜風發病機制中的重要作用，抗氧化劑在白癜風治療中的作用逐漸引起重視。9Jeong等10研究發現槲皮素和綠茶提取物具有較強的抗氧化作用，可以抵抗氧化應急對細胞的損傷，對H2O2誘導的Mel－Ab細胞損傷具有保護作用。Rojas等11研究發現，外用抗氧化劑及線粒體刺激劑聯合口服抗氧化劑及苯丙氨酸治療穩定型白癜風療效最好。作者分析該療法可能是通過糾正ROS造成的細胞和線粒體損傷使黑素細胞功能得到恢復。本實驗使用的人參皂苷Rb1是近年來研究較多的一類人參單體，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力和增強記憶力等功效。4，12

50 mg/L人參皂苷Rb1預處理后H2O2所致B16F10黑素瘤細胞活力降低明顯受到抑制，減少了細胞凋亡的發生，這說明人參皂苷Rb1對氧化應激損傷致B16F10細胞凋亡具有保護作用。此外，實驗結果還顯示，50 mg/L人參皂苷Rb1能夠有效地減少細胞內LDH漏出量，部分恢復細胞線粒體膜電位水平。近年來研究發現，線粒體除了具有細胞能量轉換的功能，還是參與細胞凋亡的重要細胞器，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。本研究結果提示，人參皂苷Rb1抗細胞凋亡的作用與減少細胞內ROS過氧化損傷和保護線粒體功能有關。

人參具有保護機體細胞免受應激損傷的作用。本研究觀察用人參的有效成分人參皂苷Rb1可以有效提高黑素瘤細胞抗氧化應激的作用，為臨床應用人參提取物治療白癜風提供了實驗依據。

1 Cao CZ，Bu LS，Gao S，et al.The injured effect of hydrogen peroxide on cultured cardiac myocytes.Prog Biochem Biophys，2000，27(6):628－632.

2 Schallreuter KU，Moore J，Wood JM，et al.Epidermal H2O2accumulation alters tetrahydrobiopterin(6BH4)recycling in vitiligo:identification of a general mechanism in regulation of all 6BH4－dependent processes.J Invest Dermatol，2001，116(1): 167－174.

3 Cario－Andre M，Gauthier Y，Pain C，et al.SP－21 Ex vivo vitiligo vs control melanocyte susceptibility to catecholam ines and hydrogen peroxide.Pigment Cell Res，2003，16(5):587－588.

4 Li YK，Chen XC，Zhu YG.Ginsenoside Rb1 attenuates okadaic acid－induced Tau protein hyperphosphorylation in rathippocampal neurons.Acta Physiologic Sinica，2005，57(2):154－160.

5Yildirim M，Baysal V，Inaloz HS，et al.The role of oxidants and antioxidants in generalized vitiligo at tissue level.JEur Acad Dermatol Venereol，2004，18(6):683－686.

6 Rokos H，Beazley WD，Schallreuter KU.Oxidative stress in vitiligo:photo－oxidation of pterins produces H2O2and pterin－6－carboxylic acid.Biochem Biophys Res Commun，2002，292(4): 805－811.

7 Sakamoto T，Repasky WT，Uchida K，et al.Modulation of cell death pathways to apoptosis and necrosis of H2O2－treated rat thymocytes by lipocortin I.Biochem Biophys Res Commun，1996，220(3):643－647.

8 Von Harsdorf R，Li PF，Dietz R.Signaling pathways in reactive oxygen species induced cardiomyocyte apoptosis.Circulation，1999，99(22):2934－2941.

9劉邦民，堅哲，李春英，等.抗氧化應激中藥在白癜風治療中的潛在應用.中國美容醫學，2012，21(8):1363－1366.

10 Jeong YM，Choi YG，Kim DS，et al.Cytoprotective effect of green tea extract and quercetin against hudrogen peroxide－induced oxidative stress.Arch Pharm Res，2005，28(1):1251－1256.

11 Rojas JE，Poleo AG.Evaluation of an antioxidant andmitochondria－stimulating cream formula on the skin of patients withstable common vitiligo.Invest Clin，2007，48:21－31.

12 Chen XC，Zhou YC，Chen Y，et al.Ginsenoside Rg1 reduces MPTP2 Induced substantianigra neuron loss by suppressing oxidative stress.Acta Pharmacol Sinica，2005，26(1):56－62.

(收稿:2013－09－03 修回:2013－12－07)

Protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2

LIU Hai-ping，GAO Hua，FU Hong-jun.Department of Dermatology，Beijing Tieying Hospital，Beijing，100078

Objective:To determine the protective effects of ginsenoside Rb1 on B16F10 cells apoptosis induced by H2O2.Methods:B16F10 cellswere random ly divided into blank control group，H2O2group and Rb1＋H2O2group.In the Rb1＋H2O2group B16F10 cells were cultured with ginsenoside Rb1(in three doses of 10mg/L，20mg/L and 50mg/L)before treated with H2O2.The viability of B16F10 cellswas calculated by MTT assay.The outleakage of lactate dehydrogenase(LDH)，mitochondrialmembrane potential and the level of apoptosisweremeasured accordingly.Results:After treated with H2O2for 24h，the viability of B16F10 cells decreased to 53.77%of the control group，while the proportion of Annexin V＆PIpositive cells significantly increased to 25.6%of the control group(P＜0.01).When pre－treated with 50mg/LRb1，the cell viability increased to 77.75%of the control group，which was 44.6%higher than that of the H2O2group(P＜0.01).The proportion of Annexin V＆PI positive cells significantly decreased to 14.4%compared with H2O2group(P＜0.01).Meanwhile ginsenoside Rb1(50mg/L)significantly decreased LDH outleakage and inhibited the decrease ofmitochondrialmembrane potential.Conclusion:Ginsenoside Rb1 can protect the B16F10 cells against H2O2－induced apoptosis and effectively improve the ability of antioxidative stress.

ginsenoside Rb1；B16F10 cells；apoptosis

1北京豐臺區鐵營醫院皮膚科，北京，100078

2首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京，100050

3山東濟寧市第一人民醫院，濟寧，272011