點(diǎn)狀掌跖角化病3家系A(chǔ)AGAB致病基因突變位點(diǎn)檢測(cè)

張 巖陳明飛吳 梅亓興亮劉 紅田洪青張福仁?

·經(jīng)驗(yàn)交流·

點(diǎn)狀掌跖角化病3家系A(chǔ)AGAB致病基因突變位點(diǎn)檢測(cè)

張 巖1，2，3陳明飛3吳 梅3亓興亮3劉 紅3田洪青3張福仁3?

目的: 檢測(cè)點(diǎn)狀掌跖角化病家系中AAGAB基因的突變。方法: 分別對(duì)來自3個(gè)家系的3例患者應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增外周血基因組AAGAB基因的10個(gè)外顯子及鄰近內(nèi)含子區(qū)域，對(duì)其產(chǎn)物直接測(cè)序和序列分析。結(jié)果: 3例患者的AAGAB基因編碼區(qū)均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。結(jié)論: AAGAB基因與本研究中的點(diǎn)狀掌跖角化病患者發(fā)病無關(guān)聯(lián)，提示可能存在其它致病基因。

點(diǎn)狀掌跖角化病； AAGAB基因； 基因突變

點(diǎn)狀掌跖角化病(punctate palmoplantar keratoderma，PPPK)是一種罕見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，1由Buschke和Fischer 1910年首次報(bào)道。22003年Martinez－Mir等3通過全基因組掃描，將該病的致病基因定位于15q22－q24。此后，Zhang等4利用連鎖分析，將該病的致病基因定位于8q24.13－24.21。2012年Giehl等5利用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)本病的致病基因是位于15q22.33－q23區(qū)間的AAGAB基因，Pohler等6對(duì)此基因進(jìn)行了功能學(xué)上的分析。本實(shí)驗(yàn)對(duì)引起點(diǎn)狀掌跖角化病的AAGAB基因進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 3個(gè)PPPK家系(圖1)共3例患者，均來自山東省，知情同意后自愿參加本研究。所有患者均有典型掌跖部位特別是受壓部位圓形或卵圓形，較硬的黃色或淡黃色角質(zhì)丘疹(圖2)。組織病理示:表皮致密而顯著的角化過度柱，呈局灶性，界限清楚，顆粒層增厚。患者發(fā)病年齡16～25歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 知情同意后，收集PPPK患者外周血4 mL，2%EDTA抗凝，利用Axygen劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增AAGAB基因全部外顯子 通過美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)的基因庫檢索到AAGAB基因序列，利用Premier Primer3軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。PCR擴(kuò)增包括AAGAB基因的編碼區(qū)的10個(gè)外顯子及其兩側(cè)翼序列。

1.2.3 DNA測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)醋酸鈉－乙醇沉淀法純化后，利用ABI 3130XL遺傳分析儀進(jìn)行直接測(cè)序，并進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

以上檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)AAGAB基因編碼區(qū)及其側(cè)翼序列的突變及多態(tài)性(圖3)。

3 討論

圖1 3例患者家系圖圖2 雙手掌散在分布圓形或橢圓形、暗黃色、堅(jiān)硬的角質(zhì)丘疹

圖3 基因測(cè)序圖

表1 AAGAB基因外顯子引物

點(diǎn)狀掌跖角化病全球范圍內(nèi)發(fā)病率約為2.5/10萬，且無性別差異。7該病主要表現(xiàn)為雙手掌和足跖部位多發(fā)的圓形或橢圓形黃色角質(zhì)丘疹，部分皮損中心呈火山口狀凹陷。8既往對(duì)該病的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其致病基因集中于以下3個(gè)區(qū)域:15q22－q24，8q24.13－24.21，15q22.33－q23，但對(duì)于前兩個(gè)區(qū)域的研究尚未發(fā)現(xiàn)致病基因，且無有效重復(fù)驗(yàn)證。2012年Giehl等5利用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)確定本病的致病基因是位于15q22.33－q23區(qū)間的AAGAB基因。Pohler等6對(duì)此基因進(jìn)行了功能上的分析，AAGAB基因全長(zhǎng)約54 kb，由10個(gè)外顯子組成，可編碼315個(gè)氨基酸殘基。該基因編碼了一個(gè)α－和γ－銜接蛋白－結(jié)合蛋白p34，是一個(gè)具有Rab樣GTP酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它在膜泡運(yùn)輸中具有重要作用。AAGAB基因突變后，p34蛋白的缺失導(dǎo)致細(xì)胞分裂加快，且極大地提高了表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)水平和酪氨酸磷酸化水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)放大和細(xì)胞過度增殖。

本研究中3個(gè)PPPK家系的先證者均具有典型的臨床及組織病理學(xué)改變，但對(duì)其AAGAB基因外顯子及側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)任何突變位點(diǎn)。我們推測(cè)原因可能是:(1)未檢測(cè)AAGAB基因的全部?jī)?nèi)含子區(qū)，突變也可能位于啟動(dòng)子區(qū)域或者3'端的非翻譯區(qū)；(2)該病具有遺傳異質(zhì)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該3個(gè)點(diǎn)狀掌跖角化病家系的發(fā)病不是由于該基因編碼區(qū)的基因突變所致。下一步我們將進(jìn)一步擴(kuò)充樣本，采用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)該病進(jìn)行研究，以確定其致病基因，同時(shí)行功能學(xué)研究，為了解本病的發(fā)病機(jī)制及基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 Brauer A.über eine besondere Form des heredit?ren Keratoms (Keratoma dissipatum hereditarium palmare et plantare).Arch Dermatol，1913，114:211－236.

2 Buschke A，F(xiàn)ischer W.Keratodermia maculosa dissem inata symmetrica palmaris et plantaris.In:Neisser A，Jacobi E，eds. Ikonographia Dermatological.Berlin:Urban－Schwarzenberg，1910.183－192.

3Martinez－Mir A，Zlotogorski A，Londono D，et al.Identification of a locus for type I punctate palmoplantar keratoderma on chromosome 15q22－q24.JMed Genet，2003，40:872－878.

4 Zhang XJ，Li M，GaoTW，et al.Identification of a locus for punctate palmoplantar keratodermas at chromosome 8q24.13－8q24.21.J Invest Dermatol，2004，122:1121－1125.

5Giehl KA，Eckstein GN，Pasternack SM，etal.Nonsensemutations in AAGAB cause punctate palmoplantar keratoderma type Buschke－Fischer－Brauer.Am JHum Genet，2012，91(4):754－ 759.

6 Pohler E，Mamai O，Hirst J，et al.Haploins ufficiency for AAGAB causes clinically heterogeneous forms of punctate palmoplantar keratoderma.Nat Genet，2012，44(11):1272－1276.

7 Kelsell DP，Stevens HP.The palmoplantar keratodermas:Much more than palms and soles.MolMed Today，1999，5:107－113.

8魏羽佳，宋守榮，王亮，等.掌跖角化病一家系9例.中華皮膚科雜志，2001，34:233.

(收稿:2014－03－20 修回:2014－04－28)

Detection ofmutations of AAGAB gene in three Chinese fam iliesw ith punctuate palmop lantar keratoderma

ZHANG Yan，CHEN Ming-fei，WU Mei，et al.Shandong Academy ofMedical Sciences，Jinan，250062

Objective:To identifymutations of AAGAB gene with punctuate palmoplantar keratoderma in Chinese patients.Methods:All ten exons and their flanking intronic sequence of AAGAB genewere amplified by polymerase chain reaction，and then，subjected to automatic DNA sequencing.Results:The pathogenicmutation was not found in all exons and their flanking intronic sequences of AAGAB gene.Conclusion:Themutation which causes PPPK in the three families is not located in the exons of AAGAB gene.Further study is needed to identify the causative gene.

punctuate palmoplantar keratoderma；AAGAB gene；mutations

1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南，250062

2濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250062

3山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

?通信作者