皮膚光老化動物模型的建立和超微結構觀察

邵瓊琰王 平任金平張小燕黎軍英戎念杭

皮膚光老化動物模型的建立和超微結構觀察

邵瓊琰1王 平2?任金平1張小燕1黎軍英3戎念杭3

目的: 構建光敏劑結合UVA誘導的小鼠皮膚光老化模型。方法: ICR小鼠分為3組:模型組外用1%甲氧沙林溶液(8－MOP)后進行UVA照射、單純UVA照射組和空白對照組。照射后觀察皮膚外觀表現、病理學變化和超微結構特點，確定各組誘導皮膚光老化進程的累積照射劑量和時間。結果: 單純UVA照射組在第45天，UVA劑量約720 J/cm2時，肉眼觀察皮膚外觀、組織病理方面和超微結構都呈現比較典型的光老化表現；模型組(8－MOP/UVA)小鼠在第3天，UVA累積劑量約47 J/ cm2時，透射電鏡下可見角質形成細胞和基底層黑素細胞的顯著凋亡(核固縮)；第5天，UVA累積劑量約78 J/cm2時，病理示:真皮層部分彈性纖維變性；隨著照射劑量的增加，第6天UVA累積劑量達95 J/cm2時，出現典型的光老化表現，透射電鏡下可清晰觀察到彈性纖維和膠原蛋白束的病理改變。結論: 8－MOP/UVA可以快速誘導小鼠皮膚光老化模型的建立。

皮膚光老化； 動物模型； 超微結構

皮膚光老化是紫外線(尤其是長波紫外線)長期照射引起的慢性光損傷。1皮膚光老化不僅導致皮膚屏障破壞引起皮膚抵抗力降低，還可致色素沉著、皺紋明顯等皮膚損容，特別是很多皮膚惡性腫瘤，如鱗狀細胞癌、基底細胞癌或黑素瘤均與慢性光損傷有關。2動物模型是研究皮膚光老化的一種重要的客觀工具。但造模方法沒有統一標準，很多方法周期較長、且判斷標準不一。因此，快速、客觀達到具有典型皮膚光老化臨床組織學改變的造模方法，對研究光老化具有實際意義。3本研究應用1%甲氧沙林溶液外用后重復長波紫外線(8－MOP/UVA)照射，觀察不同劑量下臨床病理學表現及超微結構變化，確定建立光老化動物模型的最佳照射劑量與時間點，為皮膚光老化研究提供一種快速、客觀的動物模型標準。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 ICR小鼠(清潔級，購自浙江中醫藥大學實驗動物中心，7～8周齡，合格證:SCXK(滬) 2008－0016，雌鼠36只，體質重20±5 g。

1.2 主要儀器和試劑 紫外線光療儀(Sigma公司)，長波紫外線輻照度監視計(Sigma公司)，熒光顯微鏡(OLYMPUSBX51，日本奧林巴斯公司)，數碼攝像系統(DP72，日本奧林巴斯公司)，甲氧沙林溶液(1%的8－MOP溶液，重慶華邦制藥有限公司)，環境透射電子顯微鏡(H－9500，Hitachi)

1.3 分組及處理 將ICR小鼠隨機分為3組:模型組(8－MOP/UVA)、單純UVA照射組和空白對照組，各12只。每只小鼠用電動剃發刀將背部毛剃干凈，面積2 cm×2 cm。空白對照組不做特殊處理。模型組:將1%甲氧沙林溶液涂抹于小鼠背部皮膚暴露部位，1～2 h后，將裝有實驗小鼠的透明盒子放在紫外線光療儀燈具正下方2 cm處，給予26 mW/cm2的UVA照射，每次10 min左右，總計6天(經用UVA輻射度監視器測得能量為1.1 mW/cm2，累積強度95 J/ cm2)。單純UVA組小鼠裸露的背部不做特殊處理，直接用紫外線光療儀照射，其余步驟同模型組，第6天和第45天輻射累積強度分別達95 J/cm2和720 J/ cm2左右時結束造模。

1.4 組織病理 造模結束后各組取皮膚組織做常規石蠟切片，HE染色，光鏡觀察皮膚表皮和真皮的組織結構。

1.5 透射電鏡掃描 選取樣本戊二醛和鋨酸雙固定，常規制作透射電鏡樣本。

2 結果

2.1 正常對照組 臨床觀察小鼠皮膚色澤正常、光滑、富有彈性(圖1a)，HE染色(圖1b)示小鼠表皮組織結構完整，表皮細胞排列整齊，有明顯的表皮突和真皮乳頭；真皮層可見波浪狀纖維組織，分布均勻，疏密有致。透射電鏡下(圖1c)可見密集的彈性纖維，形狀細長均勻、線形分布，排列方向一致，被包裹在密集的膠原蛋白網中；整個真皮層可見膠原蛋白束，它們排列密集，橫截面直徑均勻。

2.2 單純UVA照射組 第6天UVA劑量約95 J/ cm2時，臨床無明顯變化(圖2a)，皮膚色澤、質地正常。HE染色和透射電鏡示皮膚結構基本正常，偶見彈性纖維斷裂(圖2b黑色箭頭)，表皮和真皮交界處的結構完整(圖2c黑色箭頭)，真皮層彈性纖維疏密有秩(圖2c)。第45天UVA劑量約720 J/cm2時，臨床病理和超微結構呈現出比較典型的光老化表現，粗細不等的皺紋(圖2d)，膠原纖維模型變性，并可見無定型物質，彈性纖維變性(圖2e黑色箭頭)，表皮層和真皮層交界處的結構完全破壞(圖2f黑色箭頭)，彈性纖維排列紊亂、斷裂、破碎(圖2f黃色箭頭)。

2.3 模型組 第3天UVA劑量約47 J/cm2時，臨床僅表現局部色素沉著(圖3a)。組織病理HE染色可見彈性組織變性開始于真皮網狀層和乳頭層交界處4(圖3b黑色箭頭)，出現破碎、斷裂、扭曲等現象。透射電鏡下可見表皮基底層黑素細胞輕度核異質(圖3c黃色箭頭)、黑素細胞核濃縮(圖3c黑色箭頭)現象；真皮層彈性纖維和膠原蛋白束未見明顯改變。

第5天UVA劑量約78 J/cm2時，小鼠背部照射區域的皮膚出現進行性彈性喪失、干燥、細小皺紋(圖3d黑色箭頭)。組織病理HE染色示表皮和真皮層明顯增厚，表皮結構基本完整，真皮乳頭突出不明顯，彈性纖維變性、破壞，不規則增厚、雜亂無章(圖3c)。透射電鏡下可見表皮基底層黑素細胞中度核異質(圖3f黃色箭頭)，部分彈性纖維扭曲、排列紊亂，散亂分布在膠原蛋白網中，部分膠原蛋白束分離、散亂、大小不一(圖3f黑色箭頭)；表皮層和真皮層交界處的結構基本完整。

圖1 空白對照組

圖2 單純UVA照射組

隨著劑量進一步增加，第6天達到95 J/cm2時小鼠背部照射區域的皮膚出現粗大的橫向皺紋(圖3g)。組織病理HE染色(圖3h)示表皮萎縮，波浪形狀異常，甚至平行；真皮層的彈性纖維發生大范圍破壞和變性，部分出現均質化，排列紊亂，分布不均勻或稀疏，并伴有炎性細胞浸潤。透射電鏡可見明顯的彈性纖維散亂，它們從膠原蛋白束中分離出來，分布不規則，周邊被一些無定型的物質包裹，可能是一些黏多糖物質；大量破碎的膠原纖維，散亂腫脹，輪廓不清呈團塊狀，部分呈均質化改變，分布在彈性基質中(圖3i黑色箭頭)；表皮和真皮層交界處的結構異常，黑素細胞出現顯著的核異質(圖3i黃色箭頭)。

3 討論

皮膚光老化的臨床跡象為光暴露部位斑駁的色素沉著，皮膚松弛、出現粗細不等的皺紋，呈皮革樣，色澤灰黃等外觀，5產生的原因是環境對皮膚日積月累的破壞作用，其中紫外線輻射是主要因素。紫外線根據波長和能量的不同分為長波紫外線(UVA，320～400 nm)、中波紫外線(UVB，290～320 nm)和短波紫外線(200～290 nm)，照射到地球表面主要是UVA和UVB，兩者對生物體影響是不同的。6UVB大多在表皮吸收，主要影響表皮細胞，即角質形成細胞；與UVB相比較，UVA可以更深入地滲透皮膚，同時影響到表皮角質形成細胞和真皮成纖維細胞，引起機體的免疫抑制、光老化、眼部損害和皮膚癌等。7－9

國內外皮膚光老化試驗研究動物模型的造模方法以及檢驗模型的成功與否仍沒有統一的標準。目前文獻上報道一般是用大鼠、小鼠或者豚鼠作為動物模型，我們選ICR小鼠建模的原因為，其價格低廉，適用性廣，而且通過適當的方法造模后，可以出現典型的光老化特征。建模方法較常用的是UVA聯合UVB造模，這種方法可能更加客觀，但造模時間較長，一般需要8～12周，10，11或者單純使用高劑量UVA，至少6周。12與單純使用高劑量UVA相比，8－MOP/UVA除了時間的優勢以外，在臨床表現方面，皮膚照射損害相對較小，皺紋卻更加明顯。有文獻報道8－MOP/ UVA作用可引起體外培養成纖維細胞迅速出現細胞衰老的改變，13通過8－MOP/UVA可以快速誘導小鼠皮膚光老化模型的建立。在初步研究中使用數量有限的小鼠，通過光老化組織學方面的驗證，以實現合理的具有成本效益的實驗評估。

圖3 模型組

組織病理學是評估皮膚光老化比較經典的實驗方法，但在早期不典型的臨床表現中，電鏡下超微結構能夠更加客觀反映紫外線照射皮膚產生的漸進性光老化組織病理變化。14我們觀察到在早期階段表皮增厚，可能是一種皮膚對外界抵抗性的自我保護反應，而晚期表皮則出現萎縮；真皮層彈性纖維一般是從網狀層和乳頭層交界處開始變性，隨著照射劑量的增加，彈性纖維從小范圍到大面積變性。電鏡下觀察到黑素體在角質細胞中分布不規則，黑色素增加，出現黑素細胞核異質現象；15，16真皮與表皮結合處的結構破壞，出現像手指樣突起的異常結構。17以上這些觀察結果與其他作者的報道類似，且都強調并認為真皮彈性組織變性是動物經過紫外線反復照射建立皮膚光老化模型最為顯著的組織學特征。14，18

目前臨床皮膚光老化的發病機制尚不明確，我們通過8－MOP/UVA更加經濟、快速的建立動物光老化模型對研究光老化機制和治療光老化有著重要的意義。

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(收稿:2013－09－27 修回:2013－11－12)

An animalmodel for photoaging induced by photosensitizer p lus ultraviolet A irradiation:pathologic and ultrastructure study

SHAO Qiong-yan，WANG Ping，REN Jin-ping，et al.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，the Second Clinical Medical College，310053

Objective:To construct amice photoagingmodel induced by photosensitizer combined with ultraviolet A(UVA).Methods:The ICRmice were divided into three groups:In group one themice were treated with topical 1%methoxypsoralen(8－MOP)solution plus repeated UVA exposure，(8－MOP/UVA)；In group two，only repeated UVA irradiation was used and group threewas blank control group.After irradiation，by observing the clinical，pathological and ultrastructural features in different stage，photoaging processwere correlated with cumulative radiation dose and time.Results:In group two when the UVA dosewas about720 J/cm2at the day 45，the clinicalmanifestations，pathology and ultrastructure showed typicalmanifestation of photoaging.In group one(8－MOP/UVA group)at the time of the day 3，with UVA dose about47 J/cm2，although no clinical changeswere found，mild broken and twisted elastic fibers at the superficial dermisand also numerous apoptotic keratinocytes and melanocytes were seen under both lightmicroscope and transmission electron microscope(TEM).Clinical changes occurred at day 5 with accumulated UVA dose about 78 J/cm2，presented with dull skin，fine lines，mottled pigmentation，accompanied by obvious degeneration of elastic fibers in the dermis.On day 6 with UVA dose about95 J/cm2，typical clinical feature of photoaging with coarse transverse wrinkles，and pathologically large proportion ofelastic fibers degenerated were presented，especially under TEM.Conclusion:An animalmodel for photoaging can be quickly induced by 8－MOP/UVA.

skin photoaging；animalmodel；ultrastructure

浙江省自然科學基金項目(編號:Y208112)

杭州市醫學重點專科專病項目(編號:20100733Q08)

1浙江中醫藥大學第二臨床學院，杭州，310053

2杭州市第三人民醫院皮膚科，浙江，310009

3浙江大學電鏡中心生物分中心，310012

?通信作者