響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的超聲提取工藝

溫海超，劉暢，計(jì)婉瑩，沈起兵，王雨童，左敏，薛照輝

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的超聲提取工藝

溫海超，劉暢，計(jì)婉瑩，沈起兵，王雨童，左敏，薛照輝*

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用中心組合（Box-Behnken）設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，分析各因素的顯著性和交互作用，通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲輔助提取鷹嘴豆異黃酮工藝。結(jié)果表明最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、液料比40∶1（mL/g）、水浴溫度65℃、超聲時(shí)間40min，在此條件下鷹嘴豆異黃酮含量為0.150 7mg/g，與理論預(yù)測(cè)值基本相符。該工藝穩(wěn)定方便，適用于鷹嘴豆異黃酮的提取。

鷹嘴豆；異黃酮；響應(yīng)面；三波長(zhǎng)法；超聲提取

鷹嘴豆（CicerarietinuML），又名桃豆、雞豆，屬豆科鷹嘴豆屬植物，因其籽粒形似鷹嘴或雞頭而得名。鷹嘴豆是世界第二大消費(fèi)豆類，產(chǎn)量居世界豆類第三位。目前在我國(guó)新疆、青島、甘肅、青海、陜西、寧夏及內(nèi)蒙古等地均有栽培[1]。鷹嘴豆除含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有鷹嘴豆牙素A（biochanin A）、芒柄花黃素、大豆黃素等異黃酮類生物活性物質(zhì)，其中以鷹嘴豆牙素A含量最高（約占總異黃酮的30%）[2-3]。故而鷹嘴豆具有食用和藥用價(jià)值，具有降血壓，降血脂，降血糖等作用[4-6]，亦可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑與其他食品材料配合制備營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品。

鷹嘴豆籽粒中鷹嘴豆牙素A含量較少，不易檢出，而發(fā)芽后鷹嘴豆芽素A會(huì)明顯提高[7]。目前檢測(cè)技術(shù)主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄板層析法等方法。高效液相色譜法需要設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，成本相對(duì)較高，但可精確測(cè)定異黃酮各組分的含量[8-9]；紫外分光光度法測(cè)定總異黃酮含量精度不高，但處理樣品操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度較快，費(fèi)用較低[10]，故參考紫外分光光度法并加以改進(jìn)，采用三波長(zhǎng)法可以排除干擾物質(zhì)，提高檢測(cè)的靈敏性[1]。因此本試驗(yàn)采用三波長(zhǎng)紫外法檢測(cè)鷹嘴豆異黃酮含量，在單因素基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對(duì)超聲輔助提取鷹嘴豆異黃酮各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝，以期為鷹嘴豆中黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆購(gòu)自新疆木壘縣，烘干，粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩備用。鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%HPLC）上海如吉生物科技公司。石油醚、乙醇等為分析純。

1.2 鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

準(zhǔn)確稱取1.0mg鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解，定容至10mL容量瓶中，配成0.1mg/mL鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)溶液置于100mL容量瓶中，定容。用紫外分光光度計(jì)掃描波長(zhǎng)200nm～350nm，采用三波長(zhǎng)掃描法，確定其最大吸收波長(zhǎng)，并繪制鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 鷹嘴豆異黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確移取2mL待測(cè)樣品于10 mL具塞比色管中，用紫外分光光度計(jì)掃描波長(zhǎng)，采用三波長(zhǎng)掃描法，選取241、261、281 nm（λ1=241 nm，λ2=261 nm，λ3= 281 nm），在200 nm～350 nm進(jìn)行掃描。計(jì)算ΔA。

根據(jù)鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算樣品中異黃酮的含量：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的異黃酮濃度，（μg/ mL）；V1為待測(cè)樣品總體積，mL；V2為測(cè)試樣品體積，mL；V3為測(cè)試樣品定容體積10，mL；M為稱取鷹嘴豆粉質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取鷹嘴豆1.000 0 g，置于試劑瓶中，以乙醇作為浸提溶劑，加入不同體積、不同濃度乙醇溶液，在不同溫度的恒溫水浴鍋中水浴1 h，放入超聲波清洗機(jī)中不同超聲時(shí)間處理，抽濾，加乙醇溶液定容至50mL，備用。依次對(duì)其進(jìn)行乙醇濃度、液料比、提取溫度及提取時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，采用Design Expert8.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)，選擇對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取具有明顯影響的3個(gè)因素：乙醇濃度（A）、液料比（B）和超聲時(shí)間（C），采用三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 The design of experimentby Box-Behnken

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0軟件進(jìn)行多元回歸及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 異黃酮波長(zhǎng)檢測(cè)

將10μg/mL鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)品置于1cm石英比色皿中，在200nm～350nm進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 鷹嘴豆芽素A紫外分光吸收光譜Fig.1 The light spectrograMof Biochanin A by UV-spectrophotometer

鷹嘴豆芽素A在261 nm處有明顯的吸收峰，試驗(yàn)選取241、261、281 nm處波長(zhǎng)，進(jìn)行三波長(zhǎng)測(cè)定鷹嘴豆芽素A的含量。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Thestandard curveof Biochanin A

回歸方程為：Y=0.134 2x-0.010 2，R2=0.999 3。提示鷹嘴豆芽素A標(biāo)準(zhǔn)品在濃度為0.2μg/mL～2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 單因素分析

2.3.1 液料比對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響

液料比對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖3。

圖3 液料比對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.3 Theeffectof solid solvent ratio on theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖3可知，鷹嘴豆異黃酮含量在液料比20∶1~ 30∶1之間，隨著液料比增加，增加了豆粉與溶劑接觸面的濃度差，提高了傳質(zhì)速率，異黃酮含量隨之增加。在超聲波提取下，當(dāng)增加溶劑時(shí)，細(xì)胞破碎完全，異黃酮充分溶解。達(dá)到液料比1∶30（mL/g）后，異黃酮含量稍有所減少。豆粉中異黃酮已經(jīng)完全溶解，含量趨于穩(wěn)定。而當(dāng)乙醇溶劑過(guò)多時(shí)，有可能其他物質(zhì)滲出，使溶液黏度增加，影響豆粉異黃酮提取。同時(shí)，溶劑使用量較大，溶劑本身對(duì)超聲波有一定的吸收損耗所致[11]。

2.3.2 乙醇體積濃度對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響

乙醇體積濃度對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積濃度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.4 Theeffectof alcoholconcentrationson theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%~80%之間，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，異黃酮含量稍有減低。異黃酮苷元一般易溶于90%~95%的甲醇、乙醇等極性溶劑中，而異黃酮苷溶于60%乙醇溶液中。因此豆粉中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)，使用低濃度極性的溶劑提取效果較好。65%乙醇體積分?jǐn)?shù)溶劑異黃酮含量達(dá)到最高，可能是65%乙醇溶劑既有利于以苷類形式存在的大部分黃酮類物質(zhì)浸出，又有利于一些游離的黃酮類物質(zhì)浸出[12]。之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，含量減少，同時(shí)提取液顏色變化明顯。這可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，豆粉中色素、脂溶性物質(zhì)、糖類及黏性物質(zhì)等物質(zhì)大量滲出，影響異黃酮提取，同時(shí)破壞了異黃酮的穩(wěn)定性[13]。故本實(shí)驗(yàn)選擇60%、70%、80%乙醇體積分?jǐn)?shù)，使用響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 水浴溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響

水浴溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖5。

圖5 水浴溫度對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.5 Theeffectofwater bath teMperatureson theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖5可知，當(dāng)水浴溫度在60℃~70℃之間，溫度越高，鷹嘴豆異黃酮含量越高，由于溫度升高加快了分子熱運(yùn)動(dòng)速度和提高了異黃酮滲透擴(kuò)散溶解能力，加快物質(zhì)的溶出，但雜質(zhì)也被提取出。當(dāng)水浴溫度超過(guò)75℃以后，異黃酮含量逐漸降低，可能溫度過(guò)高，異黃酮組織結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性被破壞，氧化分解，異黃酮含量降低。同時(shí)，溫度過(guò)高，溶劑揮發(fā)，造成溶劑損失，影響豆粉異黃酮提取效果[14]。本實(shí)驗(yàn)選擇65℃水浴溫度，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響

超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖6。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.6 Theeffectof ultrasonic timeon theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖6可知，超聲時(shí)間20min~25min之間，隨著時(shí)間增加，異黃酮含量逐漸增加，主要由于超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用，擊破植物細(xì)胞膜，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而增加了溶劑向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，加速豆粉中異黃酮進(jìn)入溶劑[14]。同時(shí)，超聲波的熱效應(yīng)使水溫基本在57℃左右，對(duì)原料起到了水浴的作用。超聲波處理在開始段，時(shí)間與有效物質(zhì)的提取率呈正相關(guān)，在達(dá)到一定時(shí)間后提取效果不再明顯，由于隨著時(shí)間增加，超聲波對(duì)細(xì)胞膜破碎作用進(jìn)一步加大，粘液等雜質(zhì)相應(yīng)增加，使浸提液粘度增大，擴(kuò)散速度降低，影響異黃酮含量[15]。本實(shí)驗(yàn)選擇20、30、40min超聲時(shí)間，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

鷹嘴豆異黃酮提取的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)對(duì)提取效果影響較顯著的因素：乙醇濃度（A）、液料比（B）和超聲時(shí)間（C），根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[16]，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了17組實(shí)驗(yàn)，其中包括5組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果Table2 The resultsof Box-Behnken experiMents

2.5 多元二次模型方程的建立與檢驗(yàn)

利用Design Expert軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到鷹嘴豆異黃酮提取的回歸方程為：Y=0.14-0.010 25A+0.003 25B+0.002 25C+ 0.003 75AB-0.003 75AC+0.002 75BC+0.001 125A2-0.003 38B2+0.004 125C2。

對(duì)響應(yīng)面多元二次模型進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果Table3 ANOVA for Response SurfaceQuadraticModel

從表3數(shù)據(jù)中可知，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型P=0.016 5＜0.05，說(shuō)明該模型二次方程顯著，表明本試驗(yàn)方法是可靠的，該方程對(duì)模擬真實(shí)的三因素三水平的分析是可行的。模型失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著（P=0.453 2＞0.05），說(shuō)明未知因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果干擾小，其決定系數(shù)為0.878 3，校正決定系數(shù)為0.722 0，說(shuō)明該二次多項(xiàng)模型71.14%的響應(yīng)值的變化能解釋，有總變異的27.80%不能用該二次多項(xiàng)模型來(lái)解釋，表明該模型的擬合度一般，用此模型可以對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取工藝過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化[17]。

對(duì)該回歸方程的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，見表4。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table4 Thesignificant test resu ltsof regression coefficients

從表4中數(shù)據(jù)可知，實(shí)驗(yàn)中A對(duì)鷹嘴豆異黃酮含量的影響顯著，表明在鷹嘴豆異黃酮提取工藝過(guò)程中，乙醇濃度對(duì)異黃酮提取有顯著的影響。

2.6 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果以及二次多項(xiàng)回歸方程，并利用Design Expert8.0軟件，獲得本實(shí)驗(yàn)鷹嘴豆異黃酮含量最高時(shí)的各因素的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78.48%、液料比40∶1、超聲時(shí)間40min。在此條件下，鷹嘴豆異黃酮含量為0.1511mg/g。對(duì)此優(yōu)化提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到操作方便，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、水浴溫度65℃和超聲時(shí)間40min，重復(fù)進(jìn)行3次，測(cè)得鷹嘴豆異黃酮含量為0.151 2、0.150 5、0.150 3mg/g，平均值為0.150 7mg/g，與理論計(jì)算值的誤差在±1%以內(nèi)，該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際的鷹嘴豆異黃酮提取情況[18-19]。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以鷹嘴豆異黃酮含量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取鷹嘴豆異黃酮工藝。選擇三波長(zhǎng)紫外分光光度法檢測(cè)異黃酮含量，有效地提高了鷹嘴豆異黃酮測(cè)定方法的靈敏性，并消除色素等脂溶性物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，具有快速、重復(fù)性好、精密度高等特點(diǎn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定鷹嘴豆異黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、液料比40∶1、水浴溫度65℃、超聲時(shí)間40min，鷹嘴豆異黃酮含量為0.151 1mg/g。在此條件下進(jìn)行的驗(yàn)證試驗(yàn)獲得異黃酮含量為0.150 7mg/g。

吳敏[1]采用三波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)得鷹嘴豆異黃酮類物質(zhì)含量為0.5mg/g；朱燕超[11]利用超聲輔助提高異黃酮含量，測(cè)得為14.49mg/g；程珍[10]測(cè)得鷹嘴豆得率為0.016%，發(fā)芽后得率為5.057%，說(shuō)明發(fā)芽可大幅度提高鷹嘴豆異黃酮含量；田春元[9]應(yīng)用高效液相色譜測(cè)得鷹嘴豆芽素A含量為7.7μg/g。本試驗(yàn)中測(cè)得異黃酮含量比HPLC測(cè)得較高，而比其他檢測(cè)含量較低，說(shuō)明本方法可以較好的測(cè)定了鷹嘴豆中異黃酮的含量，為鷹嘴豆異黃酮更好利用和檢測(cè)提供了參考。與傳統(tǒng)法相比，優(yōu)化后的超聲提取顯著提高了鷹嘴豆異黃酮的含量，該提取工藝穩(wěn)定環(huán)保，有明顯的優(yōu)勢(shì)和較好的應(yīng)用前景。

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OptiMization of Ultrasonic Extraction of Isoflavone froMChickpea Using Response Surface Methodology

WENHai-chao，LIUChang，JIWan-ying，SHENQi-bing，WANGYU-tong，ZUOMin，XUEZhao-hui*
（SchoolofChemicalEngineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Based on single factor testaccording to the centralcomposite（Box-Behnken）to design three factors and three levels，significantand interaction on various factorswere analyzed to optimization of the ultrasonic assisted extraction ofchickpea Isoflavonesby responsesurfacemethodology.The resultsshowed that theoptimuMtechnologicalmethod toextracted isoflavones froMchickpeawasas follows：ethanolconcentration 78%，liquidsolid ratio 40∶1，extracting temperature 65℃and ultrasonic extraction time 40min.In this case，the extracting ofisoflavone reaches0.1507mg/g，under theseconditions，contentof flavonoids froMchickpeawas0.1507mg/g，which was basically accorded with theoretical prediction value.The proposed technology is stable and convenient，and suitable for isoflavonesextraction ofchickpea.

Cicer arietinuML；isoflavone；response surfacemethodology；three-wavelengthmethod；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.008

2014-09-15

天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃

溫海超（1990—），女（漢），在讀碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)及功能性食品研究。

*通信作者：薛照輝（1973—），男（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)及功能性食品研究。