動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

王鳳，章怡祎，劉萍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)嚴(yán)重危害人類生命健康，是導(dǎo)致人類死亡的“頭號殺手”。有關(guān)AS的確切病因尚不清楚。因此，國內(nèi)外學(xué)者從不同側(cè)面提出諸多學(xué)說，如脂質(zhì)浸潤學(xué)說、損傷-反應(yīng)學(xué)說和炎癥學(xué)說等，但均不能全面解釋AS的發(fā)生與發(fā)展。鑒于AS是多因素共同作用的結(jié)果，對AS病因病機(jī)的探討、治療對策的探索和防治藥物的研發(fā)，成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題。而展開此項(xiàng)研究的重要工具就是研究并建立可靠的AS動(dòng)物模型。作者就各種模型的研究現(xiàn)狀及評價(jià)作一綜述，以期對深入研究和指導(dǎo)臨床能有所獲益。

1 AS模型的研究概況

1.1 AS模型動(dòng)物的選擇

1.1.1 AS模型大鼠 AS模型大鼠應(yīng)用較廣，是因其飼養(yǎng)方便、獲取簡易、生存能力強(qiáng)且手術(shù)耐受性好，但是其體形及動(dòng)脈小，無膽囊，對外源性膽固醇吸收率低，具有抗實(shí)驗(yàn)性AS特性等不利因素[1]。連偉光等[2]認(rèn)為,HFJ大鼠AS模型特點(diǎn)更為顯著，可為AS研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系。

1.1.2 AS模型小鼠 利用小白鼠制造實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿⊙槐恪?dòng)態(tài)觀察較難，所以很少采用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)，已成功研制出不少新的AS模型小鼠，如轉(zhuǎn)載脂蛋白E3(Leiden)基因小鼠模型和載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠模型[3]，之后產(chǎn)生了目前應(yīng)用最為廣泛的ApoE缺陷株(ApoE-/-)和LDL受體缺陷株(LDL-R-/-)模型小鼠。這類小鼠可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣病變，如同時(shí)配合高脂飲食，能夠產(chǎn)生易損斑塊或形成血栓。

鼠模型的病變具有兩大優(yōu)勢：首先，病變的形態(tài)與人類產(chǎn)生的十分相似；其次，斑塊的破裂位置也與人類相似，同樣是發(fā)生在斑塊的肩部。然而，與人類不同的是，鼠模型的斑塊破裂處缺乏纖維蛋白和血栓形成。由此可見此類模型需要進(jìn)一步改進(jìn)，以更符合人類病變的特征。

1.1.3 AS模型兔 兔為最早用于復(fù)制AS模型的動(dòng)物，主要有新西蘭家兔(NZW兔)、日本大耳白兔(JW兔)等。兔對外源性膽固醇吸收率高，對高血脂清除力低，采用多種方法聯(lián)合，易成模，且不同的飲食結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生不同類型的AS斑塊。此外，兔的體型大小非常適合制作動(dòng)物模型，飼養(yǎng)方便，費(fèi)用也能夠承受，至今仍然被廣泛應(yīng)用。但是兔子是草食性動(dòng)物，不易自發(fā)性產(chǎn)生AS，而且建模時(shí)的高脂飼養(yǎng)組方、喂飼方法、所用時(shí)間不同，使其病變特點(diǎn)亦與人體不同。同時(shí)，兔抵抗力差，易繼發(fā)感染而死亡，并且用藥量大，形成典型的AS病理學(xué)改變需8～12周[1]。另外，渡邊兔(WHHL兔)和圣·托馬斯兔是研究高膽固酵血癥和AS常用的兩個(gè)自發(fā)性動(dòng)物模型。

1.1.4 AS模型小型豬 AS模型小型豬是現(xiàn)今較理想而且易得的研究AS的工具之一。雖然購買和飼養(yǎng)小型豬的費(fèi)用較高，但是小型豬的飲食結(jié)構(gòu)以及心血管系統(tǒng)在解剖、生理等方面近似于人類，即使在正常飲食時(shí)小型豬也會(huì)產(chǎn)生AS，且隨著飼養(yǎng)時(shí)間增長，還可自發(fā)產(chǎn)生AS[4]。

1.1.5 其它動(dòng)脈粥樣硬化模型 除此之外，還有使用鴿、鵪鶉、犬、猴子等動(dòng)物。如李潤琴等[5]使用高脂飼料喂養(yǎng)鵪鶉發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)動(dòng)物動(dòng)脈發(fā)生了粥樣變，出現(xiàn)典型的AS的病理形態(tài)學(xué)改變，故也較多用于抗AS藥物的評價(jià)。給予猴類高膽固醇飲食，可以發(fā)展成與人類相同的AS病變，但其價(jià)格昂貴，而且多是受保護(hù)的物種，因此，目前一般只限于AS復(fù)雜因素如精神壓力的研究[6]。對犬進(jìn)行高膽固醇喂養(yǎng)通常不發(fā)生動(dòng)脈硬化，因此較難模仿人類的AS狹窄模型[7]。

1.2 復(fù)制AS模型的概況

1.2.1 飼喂法 此法是AS研究中最常用的造模方法之一，已被眾多的研究者所接受。鑒于脂質(zhì)代謝的差異，所用飼料是在基礎(chǔ)飼料、膽固醇、蛋黃、豬油的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捎貌煌浞浇M成。李然等[8]采用不同飼料結(jié)合L-蛋氨酸配方，研究大鼠高脂高同型半胱氨酸(HHcy)血癥模型。張璞璞等[9]研究采用高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)結(jié)合球囊損傷腹主動(dòng)脈的方法，建立了兔高同型半胱氨酸血癥及其所致AS模型。此外，還有采用高脂飼料結(jié)合丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)成功復(fù)制AS動(dòng)物模型。PTU通過對甲狀腺功能的抑制，從而降低兔的新陳代謝，減少脂類消耗，促進(jìn)脂類底物的利用，從而提高脂肪組織對甘油三酯的攝取能力。但PTU應(yīng)用于AS模型大鼠復(fù)制中對大鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生較明顯的損傷，所以，對應(yīng)用PTU有待進(jìn)一步探討[10]。

1.2.2 灌胃法 王茁伉等[11]選用雄性日本大耳白兔，采用脂肪乳劑灌胃法(脂肪乳劑按膽固醇∶豬油∶蛋黃粉=1∶5∶4配制)加同步氮?dú)鈸p傷(歷時(shí)5 min，150 ml·min-1氮?dú)饬鲹p傷血管內(nèi)皮)，有效地建立了兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型。連偉光等[2]采用高脂飲食、免疫損傷并結(jié)合維生素D3灌胃的方法，成功建立了HFJ大鼠和Wistar大鼠AS模型。吳楠等[12]采用維生素D3腹腔注射+高脂飼料(不含丙基硫氧嘧啶)+丙基硫氧嘧啶灌胃的方法，可建立典型的動(dòng)脈粥樣硬化模型，與維生素D3腹腔注射+高脂飼料(含丙基硫氧嘧啶)進(jìn)食組相比較，成模率高，死亡率低。

1.2.3 注射法 大量研究表明，人類動(dòng)脈硬化的血管壁中含有大量的鈣，其含量與冠心病的病變程度呈正相關(guān)。Bennani-Kabchi等[13]發(fā)現(xiàn),維生素D3有利于損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血漿脂質(zhì)及鈣對血管壁的侵入和沉積，促使血管鈣化，而血管的鈣化參與AS的產(chǎn)生和發(fā)展過程，從而加速AS形成。基于此種思路，周紅等[14]以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了3種維生素D3的不同給藥劑量，在不同的時(shí)間給予腹腔注射，誘導(dǎo)出的動(dòng)物血脂水平都有增高，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管病變不盡相同，以中劑量組建立了的模型較理想。

1.2.4 機(jī)械損傷法 現(xiàn)有文獻(xiàn)已報(bào)道了球囊法、輻射損傷法、空氣干燥法、下丘腦弓狀核損傷法、頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除法等。王春田等[15]采用高脂飲食聯(lián)合球囊損傷動(dòng)脈內(nèi)膜的方法誘導(dǎo)大鼠腹主動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型,結(jié)果證明該法具有可靠性強(qiáng)，可重復(fù)性高，更符合臨床動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展過程等優(yōu)點(diǎn)。Cottin等[16]對兔經(jīng)血管內(nèi)192Irg輻射，并飼喂2%的高膽固醇飼料。2周時(shí)被輻射的動(dòng)脈有局灶性的巨噬細(xì)胞內(nèi)皮下黏附及內(nèi)皮的損傷，6周時(shí)可觀察到血管內(nèi)AS斑塊明顯增加。

1.2.5 免疫損傷法 AS的發(fā)病機(jī)制有免疫因素的存在，所以可以從免疫學(xué)的角度來探討AS模型，如使用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、肺炎衣原體、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、幽門螺桿菌、內(nèi)毒素等進(jìn)行免疫刺激，從而誘發(fā)AS的產(chǎn)生。

連偉光等[2]采用高脂飼料飼喂大鼠，并采用牛血清白蛋白(40 mg·kg-1)和卵清白蛋白(2.5 mg·kg-1)進(jìn)行免疫損傷，并輔以維生素D3(25萬U·kg-1)灌胃，成功建立了HFJ大鼠動(dòng)脈粥樣硬化疾病動(dòng)物模型，可為動(dòng)脈粥樣硬化研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系。劉劍剛等[17]采用高脂飼料結(jié)合經(jīng)兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白的方法，導(dǎo)致兔AS斑塊形成和血脂水平、炎癥因子、血小板聚集及血管活性物質(zhì)等經(jīng)典指標(biāo)的異常(有顯著相關(guān)性)，具有評價(jià)價(jià)值。曹佳超等[18]從不同角度報(bào)道了Cpn與AS的相關(guān)性。

1.2.6 基因改造法 各種基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠是近年來的研究熱點(diǎn)之一。ApoE和LDL-R基因敲除鼠可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，是動(dòng)脈粥樣硬化研究的常用模型。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用基因打靶技術(shù)建立的白介素-1、C反應(yīng)蛋白、清道夫受體、IgG Fc、補(bǔ)體C1q及CD44等模型,對研究動(dòng)脈粥樣硬化中炎癥和免疫因子的作用機(jī)制起了重要作用[19]。近來成功報(bào)道的通過在受精卵中表達(dá)RNA干擾序列而建立的遺傳性基因敲除小鼠模型，技術(shù)應(yīng)用成熟,可操作性強(qiáng)，時(shí)間上較基因敲除大為縮短[20]。但是由于基因改造小鼠體積小，臨床性檢查評估很難，與人類脂類代謝差異較大,尤其是某些在人體表達(dá)的脂蛋白代謝基因在小鼠體內(nèi)卻不表達(dá)，如CETP等局限性，使得家兔模型在AS研究中價(jià)值凸現(xiàn)，如天然LDL受體缺陷的遺傳性高脂血癥WHHL兔，其表型比LDL受體基因敲除小鼠更接近人類疾病，曾經(jīng)廣泛地用于高脂血癥的研究，但也有待進(jìn)一步改造。繼續(xù)尋找更符合人類自身特點(diǎn)的AS模型依然是本研究領(lǐng)域的重要課題。

2 對AS模型的評價(jià)

動(dòng)物模型是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究中不可替代的一種重要工具，但模型只是模擬，而不是原型，它的建立方法的逐步改進(jìn)，是基于人們對AS發(fā)病機(jī)制研究認(rèn)識(shí)的不斷飛躍。無論哪一種As動(dòng)物模型的建立，都是從AS的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，基于不同的研究目的，采取不同的方法。如根據(jù)AS形成的脂質(zhì)浸潤學(xué)說，采用高脂飼料喂養(yǎng)法;根據(jù)損傷-反應(yīng)學(xué)說，采用機(jī)械損傷法;根據(jù)炎癥學(xué)說，采用免疫損傷法等。每種方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，如高脂飼養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)是接近人類飲食習(xí)慣，造成的模型較接近人類病變，缺點(diǎn)是沒有統(tǒng)一的飼料成分配比比例，可重復(fù)性較低，造模周期相對較長，模型成功率不高。機(jī)械損傷法建立模型快速并且AS的部位明確，缺點(diǎn)是手術(shù)要求極高，術(shù)后易感染等，對動(dòng)物損害較大，造模成功率受到影響。免疫損傷法給我們了一個(gè)研究AS模型的新的方向，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，來尋找AS的病因，此種方法制造的病變模型形成較快，易于制作，可以為使用疫苗防治AS的發(fā)生提供思路。但這只是起步階段，還有很多技術(shù)問題有待攻克，有很漫長的研究之路要走。

自1992年美國洛克菲勒大學(xué)生化遺傳與代謝實(shí)驗(yàn)室和北卡羅萊那大學(xué)病理遺傳實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用胚胎干細(xì)胞基因敲除(gene knockout)技術(shù)培育成ApoE基因敲除小鼠亦稱ApoE基因缺陷小鼠后，ApoE基因敲除小鼠也成為目前AS研究中應(yīng)用最多的基因工程動(dòng)物，因?yàn)樗梢杂糜谙到y(tǒng)地研究某個(gè)基因或者某幾個(gè)基因和AS的關(guān)系，從基因水平闡釋病因病機(jī)，確定某一確切基因和發(fā)病的相關(guān)性，從而為從基因?qū)用嬷委熂膊√峁├碚撘罁?jù)，它使人類對于AS的認(rèn)識(shí)登上了一個(gè)新臺(tái)階，促進(jìn)了人類對AS的新探索。但是，此動(dòng)物模型較局限，ApoE對AS作用機(jī)制還有待深入研究，另外還有一個(gè)很重要的缺陷需要注意，即基因改變以后，可能對動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞或代謝產(chǎn)生其他可知或不可知的影響，從而可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及增加對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的難度，而且操作技術(shù)要求很高，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求精良，鑒于目前我國國情，還很難在全國廣泛推廣使用。

根據(jù)多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的鈣超載機(jī)制，在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，選用大劑量的維生素D3，無論是采取腹腔注射的方法，還是實(shí)施灌胃法，均可在較短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致動(dòng)物血鈣明顯升高，誘發(fā)動(dòng)脈管壁損傷和硬化，形成明顯的斑塊，這是一種用維生素D3快速誘導(dǎo)AS模型的方法優(yōu)點(diǎn);而其缺點(diǎn)是導(dǎo)致了動(dòng)物食欲減退，食量有所下降，體質(zhì)量也繼而下降，多器官功能異常，甚至死亡率增加。

單一方法制作的動(dòng)物模型是絕對不能如實(shí)準(zhǔn)確代表動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病本質(zhì)。由于AS是在多種遺傳及環(huán)境因素參與下發(fā)病，是由多個(gè)重要功能基因異常、血脂代謝異常及炎癥反應(yīng)和免疫因子等互相聯(lián)系難以分割的多因素共同作用下的一個(gè)緩慢復(fù)雜的過程，加上動(dòng)物本身的生理特點(diǎn)及動(dòng)物與人的種屬差異，導(dǎo)致無論哪種方法，都不能翔實(shí)全面地復(fù)制出人類AS的病理變化和過程。所以在實(shí)際運(yùn)用中，多以高脂飼養(yǎng)為基礎(chǔ)，同時(shí)疊加各種損傷因素和致炎、致免疫反應(yīng)因子的破壞作用，以加速血管內(nèi)皮損傷，加速AS的形成。也只有采用多種方法聯(lián)合，以摸索出更接近動(dòng)脈粥樣硬化本質(zhì)，才能為建立操作簡便、可靠、可重復(fù)的AS動(dòng)物模型，提供可借鑒的思路,從而為AS診斷、防治及治療藥物的研發(fā)創(chuàng)造更好的基礎(chǔ)條件。

[1] 楊梅，周建光，曹海濤，等.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立與評價(jià)[J].醫(yī)療裝備，2010，23(6)：35-37．

[2] 連偉光，鄭龍，尤紅煜，等.HFJ大鼠與Wistar大鼠用于動(dòng)脈粥樣硬化造模的比較研究[J].四川動(dòng)物，2013，32(7)：588-594．

[3] BURNETT M S，GAYDOS C A，MADICO G E，et al.Atherosclerosis in apoE knockout mice infected with multiple pathogens[J].J Infect Dis，2001，183(2):226-231．

[4] BERGEN W G，MERSMANN H J.Comparative aspects of lipid metabolism:impact on contemporary research and use of animal models[J].J Nutr，2005，135:2499-2502．

[5] 李潤琴，孫培軍.益氣養(yǎng)陰軟堅(jiān)化痰方對實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化鵪鶉血脂及形態(tài)學(xué)影響[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，30(3):2441．

[6] 許金鵬，王綠婭.關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的動(dòng)物模型[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2004，12(4):444-446．

[7] 劉恒方，黃曉松，劉尊敬，等.頸動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型制作的研究進(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2006，33(1):62-65．

[8] 李然，劉建勛，李磊，等.不同飼料配方對大鼠TC，LDL-C，Hcy的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(9):207-209．

[9] 張璞璞，袁吉祥，姚成立，等.高同型半胱氨酸血癥及其所致動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的復(fù)制[J].中國組織工程研究，2012，16(7):1233-1236．

[10] 連偉光，鄭龍，尤紅煜，等.應(yīng)用丙基硫氧嘧啶復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型中對大鼠心臟損傷的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2013，29(2):125-127．

[11] 王茁伉，彭成，王忠，等.脂肪乳劑灌胃加氮?dú)鈸p傷建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(11):176-179．

[12] 吳楠，陳平圣，李靜.丙基硫氧嘧啶不同攝入方式對大鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2011，39(2)：142-146.

[13] BENNANI-KABCHI N，KEHEL L，EIBOUAYADI F，et al.New model of atherosclerosis in insulin resistant sand rats:hypercholesterolemia combined with D2vitamin[J].Atherosclerosis，2000，150:55-61．

[14] 周紅，吳曉燕，袁藝標(biāo)，等.三種劑量維生素D3結(jié)合高脂飼料建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的比較[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2012，20(11)：995-998．

[15] 王春田，馬賢德.高脂聯(lián)合機(jī)械性損傷法復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2012，26(6):32-33．

[16] COTTIN Y，KOLLUM M，KOLODGIE F D，et al.Intravascular radiation accelerates atherosclerotic lesion formation of hypercholesterolemic rabbits[J].Cardiovasc Radiat Med，2001，2(4):231-240．

[17] 劉劍剛，董國菊，馬魯波，等.免疫損傷結(jié)合高脂飼料致兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的相關(guān)因素分析[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2013，30(2):32-38．

[18] 曹佳超，張東.肺炎衣原體感染與動(dòng)脈粥樣硬化[J].中國卒中雜志，2013，8(1):64-67．

[19] 謝謹(jǐn)捷，楊婭.基因敲除鼠在動(dòng)脈粥樣硬化研究中的應(yīng)用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28(4):400-402．

[20] ROSS C J，LIU G，KUIVENHOVEN J A，et al.Complete rescue of lipoprotein lipase-deficient mice by somatic gene transfer of the naturally occurring LPLS447X beneficial mutation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25:2143-2150．