椎間盤細胞老化信號通路及檢測方法的研究進展

史航，吳小濤

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫院 骨科，江蘇 南京 210009)

椎間盤位于兩個相鄰的椎體之間，起連接作用，對人體的運動、穩定、平衡等有著重要的生物學意義。目前，椎間盤退行性病變的患病率顯著增加，它是一種與年齡相關的疾病，引起退變的因素有很多，其共同特點是髓核細胞(nucleus pulposus chondrocyte，NPC)數量減少和功能減退、細胞外基質含量下降且比例失調,這些都涉及到椎間盤細胞老化或凋亡。椎間盤細胞的老化和凋亡是組織退變過程中非常關鍵的因素[1]。通過對椎間盤退變的機制研究發現，椎間盤退行性改變是從髓核細胞衰老開始，并進行程序性退變的過程[2]。

1 椎間盤細胞的老化現象

20世紀60年代初，Hayflick等[3]在體外培養人成纖維細胞時發現，在細胞連續分裂幾次后即失去增殖能力，他們將這一特殊的細胞生命活動狀態命名為細胞老化(senescence)。細胞發生老化時，仍具有一定的代謝活性，可分泌合成多種基質，但分泌表型已發生改變，細胞永久地停滯在G1期，無法進行有絲分裂而增殖。研究表明，大量老化細胞的集聚將會導致組織器官內功能細胞數目的減少及活性的降低，從而引起一系列如骨關節炎、皮膚衰老等退行性疾病，椎間盤的退行性變也不除外[4-5]。Evans等[6]研究發現，退變的椎間盤內存在細胞老化現象。Kim等[7]研究發現，在椎間盤退行性變中，隨著年齡的增長，老化髓核細胞的數量逐漸增加，端粒酶活性降低，端粒的長度也隨之縮短。Roberts等[8]研究發現，在突出的椎間盤組織中β-半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)陽性細胞數目增多，而且髓核細胞的陽性率比纖維環細胞的要高。Gruber等[9-10]研究發現，隨著椎間盤退變程度(按Thompson分級)的加重，SA-β-gal陽性率顯著增加。

2 細胞老化機制及椎間盤細胞老化的信號通路

2.1 細胞老化機制

細胞老化是指體細胞在受到各種內外環境因素刺激下，復制一定次數后失去了分裂增殖能力，功能減退，不可逆地停滯在G1/S期，進入無法增殖的狀態[11]。細胞老化的一個重要機制是細胞連續性分裂后，染色體端粒進行性縮短和端粒功能異常，后者模擬DNA損傷信號，上調p53基因表達，隨后p53會激活其下游基因p21，從而抑制CDK2-Cyclin E的活性，降低了視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)蛋白的磷酸化程度，進而失活主要負責細胞周期遞進的核轉錄因子E2F，形成了由p53-p21-pRB信號介導的復制性老化(replicative senescence，RS)[12-13]。此外，在某些應激因素(如異常應力、氧化應激、營養障礙等)刺激下，細胞在尚未經歷過多的有絲分裂且維持一定端粒長度情況下能使p16表達上調，后者通過取代細胞周期蛋白Cyclin D與CDK4/6結合，使Cyclin D-CDK4/6活性受到抑制，從而使pRB處于去磷酸化狀態而減少轉錄因子E2F的釋放，進而阻止DNA的合成，使細胞停滯在G1/S期，從而阻礙了細胞的分裂增殖，最終形成了由p16-pRB信號介導的應激誘導的過早老化(stress induced premature senescence，SIPS)[14-15]。

目前認為，細胞老化的p53-p21-pRB與p16-pRB兩條信號通路之間存在著廣泛的重疊效應。研究發現，當使p16基因表達沉默后，細胞在某些應激環境下同樣可發生過早老化，說明p53-p21-pRB信號通路也參與應激誘導的過早老化的發生[16-17]。此外，p16的同源蛋白p14對p53具有調節作用，p14可通過一系列反應抑制p53的降解，從而維持p53蛋白的穩定與活性[18]。Han等[19]在人類成纖維細胞中發現，p16能增加p21蛋白的穩定性，p21則通過轉錄因子Sp1而激活p16的基因表達，協同抑制細胞周期。

2.2 椎間盤細胞老化的信號通路

椎間盤是人體最大的缺血器官，在承受應力負荷的同時，其內的髓核細胞尚面臨著缺血缺氧、營養匱乏等不利環境。研究[6，9-10]顯示,在上述椎間盤環境的作用下，約30%的髓核細胞逐漸發生老化，且老化細胞所占比例隨椎間盤退變程度的加重而增大。Kim等[7]通過對人類椎間盤退變機制的研究發現，在衰老的髓核細胞中均表達p53、p21和pRB，而且端粒進行性縮短，端粒酶活性降低。Liang等[20]研究證實，將端粒酶基因轉入髓核細胞內，端粒酶活性明顯增強，其調節的p53表達水平降低。以上研究均提示由p53-p21-pRB信號通路介導的髓核細胞復制性老化在椎間盤退行性變過程中起著重要的作用。

然而，Dang等[21]研究發現青少年甚至兒童也會發生椎間盤退行性改變。Le Maitre等[1]研究發現，在青少年退變的椎間盤中，老化的椎間盤細胞與年齡、端粒長度無明顯的相關性，而與p16的高表達有關。說明p16-pRB信號通路介導的應激誘導的過早老化亦存在于椎間盤退變過程中。

3 細胞老化的基本特征及檢測方法

3.1 細胞周期停滯

細胞周期停滯是細胞老化的一個基本特征，也是用于體外鑒定細胞老化的一個重要指標[22]。為了檢測細胞是否躍出了細胞周期，人們通常檢測增殖相關提示因子Ki-67的表達程度；或者通過將溴脫氧尿嘧啶摻入到細胞培養基中，觀察是否合成新的DNA。通過流式細胞術可以觀察到細胞群中處于不同周期細胞的比例：細胞老化主要表現為G1期阻滯，但也可以伴隨G2/M期阻滯或者直接由G2/M期阻滯誘導形成[23-24]。

3.2 細胞形態學改變

雖然細胞周期阻滯，DNA停止了復制，但老化細胞中RNA與蛋白質含量均比正常細胞中明顯增多[25]。這是因為雖然細胞進入老化階段后，蛋白質的整體合成能力下降，但是蛋白質的降解體系受到更加明顯的抑制，從而導致蛋白質在細胞內累積。同樣的情況應該也發生在RNA的合成和分解過程中。這種生物大分子的積累使老化細胞的形態發生改變，如老化髓核細胞表現為細胞體積增大、胞質變脆、胞漿空泡化明顯。然而，并不是所有的細胞老化都會出現上述所有類型的細胞形態學改變。例如，在一些由于基因突變或表達異常導致的細胞老化中，其細胞形態改變就不典型[22]。

3.3 老化相關β-半乳糖苷酶染色

通過細胞形態判定細胞老化存在主觀性，檢測細胞周期停滯缺乏直觀性，往往很難在組織中直接觀察到老化細胞。而與老化相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色為檢測細胞老化提供了一種新的方法[26]。β-半乳糖苷酶主要存在于溶酶體內，該酶在pH 4.2～pH 4.6的條件下活性最高，在中性條件下檢測不到其活性。當細胞發生老化時，溶酶體膨脹、數目增多，β-半乳糖苷酶在溶酶體中明顯累積，從而保證了即使在pH 6的條件下依然可以檢測到該酶的殘余活性[26-27]。因此,人們將在pH 6時仍可檢測到活性的β-半乳糖苷酶稱為SA-β-gal。然而，β-半乳糖苷酶的活性上調也可在一些非老化的腫瘤或永生化細胞內出現，目前仍缺乏能特異性反映細胞老化狀態的生化指標。盡管如此，因為其敏感性、特異性等優勢，SA-β-gal染色仍然是目前檢測細胞老化的多種方法中應用最廣泛的一種方法。

3.4 老化相關異染色質集落(senescence associated heterochromatin foci，SAHF)形成

SAHF形成是描述細胞老化狀態的一項特異指標，它的主要表現是常染色質DNA凝集，并形成致密、大小不等的異染色質顆粒[28-29]，而每一個異染色質顆粒大多來自一條單獨的染色體[30-31]。SAHF在不可逆的細胞周期停滯中發揮著重要作用[28]。在SAHF中，H3型組蛋白(histone H3)第9位賴氨酸(H3K9)三甲基化水平明顯增加，并以此為錨定點來吸引各亞型異染色質蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)聚集[30]；同時會出現染色質上H1型組蛋白(histone H1)的剝離和高遷移率A族蛋白(high-mobility group A proteins，HMGA proteins)、非經典組蛋白macroH2A的沉積[29，31-32]。現在普遍認為，SAHF是在p16-pRB通路和以組蛋白抑制蛋白A(histone repressor A，HIRA)為核心的組蛋白分子伴侶復合物協同作用下形成的[33]。當p16表達水平上調時，E2F的轉錄因子活性受到明顯抑制，結合在E2F靶標基因上的組蛋白甲基化水平隨之升高，從而為HP1的結合以及SAHF的形成提供了靶點[33-34]。由于SAHF的特征性結構，近年來它已經作為新的標志物用于判定細胞老化。

3.5 端粒功能異常

端粒是位于染色體末端的DNA重復序列，是由短的多重復的非轉錄序列(TTAGGG)及一些結合蛋白組成的特殊結構，它能保護染色體末端免于融合和退化，在染色體定位、復制、保護和調控細胞生長等方面具有重要作用[35]。然而，由于DNA聚合酶無法完全復制染色體的滯后鏈，導致端粒DNA重復序列隨著復制次數的增加而不斷縮短，當端粒縮短到一定程度時，細胞便會開啟自發性老化程序[36]。人們可以通過檢測端粒序列的長度和端粒逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)的酶活性來評估端粒的功能。因而，端粒功能異常也被認為是一種可作為評判細胞老化的潛在標志物。

4 小結與展望

隨著椎間盤退變的進行性加重，老化的髓核細胞在體內不斷聚集，為了進一步了解椎間盤細胞老化在椎間盤退變中的機制，將來的研究可采用人正常髓核細胞系，通過體外連續培養傳代、氧化應激干預分別建立髓核細胞復制性老化和應激誘導的過早老化模型，探索p53-p21-pRB和p16-pRB通路在髓核細胞老化過程中的信號介導與交通，尋找髓核細胞老化的關鍵調控信號及老化過程中特異性的標志物，為生物學治療更具針對性地選擇抗老化靶點來修復椎間盤退變打開嶄新思路。

目前廣泛應用判定細胞老化基本特征的方法有細胞周期停滯、細胞形態學改變、SA-β-gal染色、SAHF形成、端粒功能異常等。我們認為，目前尚無任何一種可以在體內外單獨、可靠地鑒定細胞老化的有效方法，在缺乏老化特異性檢測指標的情況下，上述多種方法的聯合應用是評價細胞老化的較好選擇。

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