腫瘤靶向特異性光學分子探針的結構與設計策略

劉杰昊等

【摘要】 腫瘤是目前嚴重影響人類健康的疾病之一，傳統的檢查方法難以從分子水平早期診斷腫瘤。光學分子成像技術是一種采用光學成像，通過分子熒光標記靶向目標，形成光學分子影像進行腫瘤早期非侵入診斷的方法。光學分子探針是光學分子成像技術的核心，如何設計出具有靶向性和高度親和力的理想探針成為當今研究的熱點。同時隨著新型成像儀器的開發和光學分子探針的不斷發展，光學成像技術將不斷完善，成為臨床分子水平早期診斷腫瘤的重要方法。

【關鍵詞】 光學分子成像； 分子探針； 分子探針設計

1 概述

腫瘤是目前嚴重危害人類健康的疾病之一，雖然隨著科技的進步，現代醫學對腫瘤的診斷水平不斷提高，但是腫瘤患者的5年生存率和生活質量仍不太理想，其中最重要的原因之一是缺乏從分子水平獲得早期腫瘤診斷信息的方法。目前，臨床上對腫瘤的診斷主要依賴于臨床癥狀、血清學檢查、常規影像學檢測等方法，如X線、X線計算機斷層攝影（CT）、放射性核素顯像、磁共振成像（MRI）和超聲診斷（US），但是腫瘤發病的早期癥狀隱匿，血清學檢測特異性較差，常規的影像學檢查手段雖然有許多優點，但從分子水平進行早期診斷還存在許多不足之處，因此，如何從分子水平對腫瘤的發生發展進行早期診斷就成為目前研究的熱點。

最新研究表明，光學分子成像技術（Optical Molecular Imaging）將成為未來診療技術發展的新方向，是繼傳統的分子成像方式之后，又一新的影像技術，將成為臨床醫生的好助手。其原理是利用生物發光、熒光蛋白或熒光染料，標記在體生命大分子，進行定性和定量研究，與磁共振、核素成像等技術相比，具有無創性、高敏感性、成像價格低、特異性強等優點[1]。光學分子成像技術主要分為以下幾大類：熒光成像（Fluorescence Imaging，FMI）、生物發光成像（Bioluminescence Imaging，BLI），拉曼成像（Raman Imaging，RI），光聲成像（Photoacoustic Imaging，PAI），活體顯微鏡（Intravital Microscopy，IVM）和光頻域成像等（Optical Frequency Domain Imaging，OFDI），其中目前應用最為廣泛的是FMI和BLI[2]。

光學分子探針是光學分子成像技術的核心理論和方法，是進行分子影像學研究的先決條件。廣義的分子探針是指能在機體內某些部位聚集，并產生影像學信號可供體外設備檢測的物質。理想的分子探針具有的生物學特性有[3]：（1）與靶向分子有高特異性和親和力；（2）分子量較小，容易穿過機體內的生理屏障，并能反映體內靶向分子的數量及空間分布；（3）無毒副作用及免疫排斥反應、性質穩定和血液清除速度快；（4）容易制備合成。

2 光學分子探針的分類與結構

根據探針的作用原理，光學分子探針分為：非特異性光學分子探針、可激活光學分子探針和特異性光學分子探針[4]。

2.1 非特異性光學分子探針 非特異性光學分子探針通常是指一些小分子游離熒光基團，經血管裂隙分布于細胞外組織中，由于病變和正常組織的灌注率或血管通透性不同，非特異性探針進入病變組織和正常組織的數量明顯不同，因而可根據不同的光學分子影像進行靶向目標的識別，但這種探針對靶向目標缺乏特異性，導致目標-背景信噪比低，成像效果差[5]。

2.2 可激活光學分子探針 可激活光學分子探針也稱作智能探針，其在初始狀態下不發出光學信號，而一旦達到靶向目標被特定的生化或物理因子激活后即可發出強烈的光學信號而被檢測[6]。

2.3 特異性光學分子探針 特異性光學分子探針又稱為靶向性探針，是指與靶向目標具有親和性的配體經過特定方法與生物素和熒光素等對比劑連接而組成。特異性光學分子探針由三部分組成：報告基團（Reporter Group）、連接基團（Spacer）和識別基團（Receptor），部分探針可不含有連接基團，且連接基團和識別基團連接后不應當影響識別基團的生物活性[7]。

2.3.1 報告基團 也稱作信號基團，其作用是可以快速地富集在體內某一部位而被光學成像設備檢測到信號。光學分子探針常見的報告基團有熒光素、熒光染料和量子點（Quantum Dots，QDs）等。

2.3.2 連接基團 也稱作連接體，是指連接報告基團和識別基團的部分，因報告基團和識別基團一般結構較為復雜，兩者如相距太近可能會導致彼此生物活性的改變，因此連接體可以減少信號基團和識別基團之間的相互反應。更為重要的是，連接體可以優化探針的藥物代謝動力學特性。連接基團通常會對探針和靶向目標蛋白的結合產生重要影響，其長度、親水性及所帶電荷等方面都是影響探針活性的關鍵因素[8]。常用的連接基團有長鏈烷基和聚乙二醇等。長鏈烷基可以改善分子探針的脂溶性，有利于探針進入細胞；聚乙二醇則可改善分子探針的水溶性，有利于減少探針和非靶向目標蛋白的非特異性結合。脂溶性好的分子探針一般經過肝膽系統代謝，而水溶性好的分子探針一般通過泌尿系統清除[9]。

2.3.3 識別基團 也稱作靶向基團，是指可以識別靶向目標蛋白并與之緊密結合，形成蛋白-探針復合物，是整個探針的核心部分。目前，科學家已經開發出多種靶向基團，包括抗體、多肽和小分子化合物等[10]。

2.3.3.1 抗體 抗體因為可以產生理想的配體-受體結合反應，且對靶向目標有極高的特異性及親和性，作用機制明確，因此被廣泛批準應用于臨床。如前列腺特異性膜抗原（Prostate-specific Membrane Antigen，PMSA）在前列腺癌的診斷、治療及預后評估等方面都發揮著重要作用，Liu等[11]應用PMSA抗原抗體成功制備了Cy5.5-CTT-54.2特異性近紅外熒光探針，經實驗表明可被用于前列腺腫瘤的靶向體外光學成像。但是抗體分子量較大，影響了探針的組織穿透力，異種抗體容易誘導機體產生不良的免疫反應，并且體內代謝緩慢，這些缺點限制了其在臨床上的應用[12]。為了改善上述不利因素，抗體片段被開發應用，大大改善了探針的藥代動力學特性，但此類探針相對于完整的抗體，其制備工藝更加復雜，價格昂貴，目前臨床上應用較少[13-14]。endprint

2.3.3.2 多肽 多肽是多個氨基酸殘基組成的肽段。小分子多肽有許多優點：（1）易于化學合成，克服了抗體異源性問題；（2）制備技術可控，能夠保證探針的物理化學及生物性能；（3）具有高度親和力；（4）分子量小，可以較容易地通過生理屏障，血液清除速度快[15-16]。因此小分子多肽可以作為理想的探針應用于光學成像。有些腫瘤可以高表達某些受體，而表皮生長因子（EGF）、奧曲肽等天然多肽能夠與這些受體特異性的結合，可用于腫瘤的檢測。王可錚等[17]用近紅外熒光染料Cy5.5標記EGF合成了探針（Cy5.5-EGF），對乳腺癌裸鼠移植瘤模型進行活體光學成像，表明探針Cy5.5-EGF可以與乳腺癌細胞表面的表皮生長因子受體（EDFR）特異性結合而用于乳腺癌的靶向診斷。Lanzardo等[18]應用近紅外熒光染料標記RGD環肽作為光學探針，用來評價整合素αvβ3受體高表達的U87MG膠質母細胞瘤細胞移植裸鼠模型，體外和體內實驗都證實，在U87MG細胞中RGD環肽與αvβ3整合素受體具有較高的特異性和親和力，表明NIRF-RGD能靈敏而特異地探測膠質母細胞瘤。但是隨著研究的深入，天然多肽已經無法滿足分子影像學的需求，因此開發針對不同腫瘤、不同表面抗原更具特異性的多肽已成為當今研究的熱點。

Smith等[19]于1985年報道了外源多肽在單鏈噬菌體表面表達的現象，從而使噬菌體展示文庫技術成為篩選腫瘤特異性多肽重要的工具并迅速應用。Chen等[20]應用噬菌體展示文庫技術篩選得到惡性神經膠質瘤U87MG細胞系導向肽CGNSNPKSC九肽序列，命名為GX1，并用近紅外熒光染料Cy5.5標記此多肽制備成了Cy5.5-CGNSNPKSC特異性光學分子探針，經體內體外實驗證實，該探針能特異性的與U87MG腫瘤結合，可用于惡性神經膠質瘤的靶向診斷。小分子多肽雖有許多優點，但其在體內易降解，部分靶點未知等缺點也是目前亟待解決的問題。

2.3.3.3 小分子化合物 某些小分子化合物如葉酸、雙磷酸鹽等能夠和腫瘤細胞膜表面一些特異性受體靶向結合，可以作為特異性靶向探針的識別基團。如葉酸受體（FR）可在大部分惡性腫瘤，如卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、腎癌、結腸癌等表面過量表達，葉酸（FA）可與葉酸受體特異性結合從而用于檢測相關惡性腫瘤。鄧大偉等[21]成功制備了葉酸-PEG-ICG-Der-01近紅外熒光靶向探針，并與過度表達葉酸受體的腫瘤靶向結合，定位準確，說明該探針具有腫瘤靶向的特性，對腫瘤的早期診斷有十分重要的意義。但小分子化合物易受體內原有分子的影響，顯像基團標記化合物后藥代動力學可能會有改變。

3 靶向光學分子探針設計的基本原則

光學分子成像探針可以看作是藥物的一個亞類，因此傳統藥物設計時所用到的知識和經驗，可以用于光學分子成像探針的設計。分子探針的理化性質，如電離常數（pKa值），脂溶性的和穩定性，被普遍認為是影響探針在體內的藥代動力學的關鍵因素，包括探針的吸收、分布、代謝和排泄。因此在成像探針的設計和開發初期應當認真考慮這些問題。分子探針的電離作用和溶解度與細胞膜的通透性密切相關。許多分子成像探針含有不同的離子基團，在生理pH值范圍內帶有不同的電荷，分子探針的總電荷或電荷分布會影響其在體內的溶解度，滲透性以及與活性位點的親和性。

3.1 生物特異性與生物活性策略 為了設計出靶向特異性光學分子探針，識別基團應當能夠與靶向目標特異性結合，而不與背景組織結合[22]。而且由于分子探針結構中既包括核心部分識別基團，也包括連接基團和報告基團，合成后得到的分子探針其生物學特性可能發生改變。因此在合成探針以前，應當對探針結構的各個組成部分與生物活性之間進行構效關系研究，在不改變探針各部分生物學活性的情況下再進行探針的合成[7]。

3.2 藥代動力學策略 傳統的靶向分子探針無論是否與靶向目標結合均能發出信號，導致目標-背景信噪比較低，成像效果不佳，必須經過一段時間的代謝，大部分未結合的游離探針被機體清除后，目標-背景信噪比增強，才能達到最佳成像效果[6]。應用此類探針需要設法盡快洗去未結合的探針，使游離探針的清除時間盡量縮短，但在實際操作中并不容易做到。新型的“可激活”靶向分子探針只有與靶向目標特異性結合之后才發出信號，因此可以有更長的清除時間，使探針在靶向組織或細胞中充分富集，目標-背景信噪比可增加數百倍。例如，利用單克隆抗體IgG合成傳統的靶向分子探針，其清除時間較長，導致了高背景信號和低目標-背景信噪比。然而，應用同樣的單克隆抗體IgG，與可激活信號載體結合后，即使未結合的探針仍然在循環中卻依然可以達到高目標-背景信噪比。

光學分子探針在進行體外實驗時通常具有較好的靶向性，但是在體內應用往往效果不佳，這是因為機體是一個非常精密的系統，許多復雜的防御機制會阻礙外源性分子在體內發揮作用。因此，理想的光學分子探針必須能夠穿過生理或藥理學屏障，以合適的濃度到達特定靶向目標并滯留一定的時間，以便在體外被光學成像手段檢測到。首先，探針必須在體內循環中保持活性并避免被網狀內皮系統（RES）攝取；其次，探針必須能夠到達靶組織內并在此富集；最后，如果探針的作用靶點在細胞內部，那么探針必須能夠穿透細胞膜。

4 靶向光學分子探針的結構設計

靶向光學分子探針的結構設計可以用（圖1）來表示。最常見的方式是識別基團通過一個連接基團與報告基團相連（圖1a），而且一種識別基團可以同時連接幾個報告基團形成分子探針進行多模態分子成像[23]。另外，多個識別基團與一個或多個報告基團連接后能與多個靶向目標特異性結合，此類探針可用于多靶向分子成像[24]。此外，許多有機或無機的納米顆?？梢酝瑫r作為識別基團和運輸載體來行使功能[25]。最新研究證實，碳納米管經表面功能化處理后，具有可以攜帶蛋白質、核酸片段及小肽段等生物分子進入細胞的能力，是一種非常有前途的運載工具。周非凡等[26]以單壁碳納米管（SWNT）作為載體和光吸收劑，制備了SWNT-PEG-mAb靶向性光熱轉換探針，經體內實驗證實該探針可以進入靶細胞內，從而達到靶向殺傷腫瘤細胞，降低正常組織損傷的目的。此外，識別基團和報告基團還可以被耦合到納米顆粒表面或內部來改善探針的信號敏感性和光穩定性[27]。第二種方式是兩種報告基團連接一種識別基團（圖1b），可激活探針或智能探針屬于此類探針范疇[28]，智能探針結構中距離較近的兩個報告基團可能會導致自淬滅（Self-quenching），當探針到達靶向目標后被相應的酶激活才會發出熒光信號。第三種方式是一種報告基團作為核心，兩種或多種識別基團與其連接（圖1c）。總的來說，探針設計方式的選擇是由多種因素共同決定的，包括具體的靶向目標以及所采用的成像方式等，為了合成理想的靶向特異性光學分子探針，探針的每一個組成部分都必須認真考慮。endprint

5 小結與展望

光學分子成像是近些年來快速發展的一項新興的技術，也是未來影像學研究的熱點。雖然靶向性探針目前仍然存在著如探針的安全性、穩定性及組織相容性等許多問題，在臨床上的應用尚不多，但隨著新型的光學分子探針會不斷設計合成，光學成像技術一定會日益成熟，并最終應用于臨床，在腫瘤的早期診斷、早期治療和治療效果監測等方面做出巨大貢獻。

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