圍絕經(jīng)期綜合征患者舌苔脫落細胞EGFR表達與中醫(yī)肝郁分級相關性的研究

張凌媛等

【摘要】 目的：探討圍絕經(jīng)期綜合征中醫(yī)肝郁分級與舌苔脫落細胞EGFR表達的相關性。方法：以30例健康婦女作為對照組，100例圍絕經(jīng)期綜合征患者作為觀察組，采用證素辨證進行中醫(yī)肝郁病理分級，免疫組化檢測舌苔脫落細胞EGFR的細胞著色強度值及陽性率。結果：觀察組舌苔脫落細胞EGFR的細胞著色強度值及陽性率顯著高于對照組（P<0.05）；觀察組不同舌苔組和不同舌質組間EGFR差異無明顯規(guī)律；觀察組舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率與肝郁病理分級呈正相關。結論：圍絕經(jīng)期綜合癥患者舌苔脫落細胞EGFR可以作為判斷肝郁病變程度的重要參考。

【關鍵詞】 圍絕經(jīng)期綜合征； 肝郁分級； 舌苔脫落細胞； EGFR

圍絕經(jīng)期綜合征（Perimenopausal Syndrome），是指絕經(jīng)前后的婦女，由于卵巢功能衰退乃至消失，雌激素分泌降低，所導致的自主神經(jīng)功能紊亂和內分泌失調的一系列癥狀。中醫(yī)藥對于圍絕經(jīng)期綜合征的治療具有獨特的療效和優(yōu)勢，近年來受到越來越多的關注。圍絕經(jīng)期綜合征在中醫(yī)學范疇屬于“經(jīng)斷前后諸證”、“絕經(jīng)前后諸證”，其形成機制與絕經(jīng)前后的生理特點有重要關系，而其中肝郁是其主要的病機之一。

舌苔脫落細胞作為舌苔的主要組成成分，其凋亡可能是影響舌苔變化的重要因素之一。EGFR作為表皮生長因子受體家族成員，與許多腫瘤細胞的增殖、血管生成及細胞凋亡的抑制有密切關系。有研究發(fā)現(xiàn)舌苔的厚薄與唾液中EGF的含量有關[1]。本研究對圍絕經(jīng)期綜合征患者舌苔脫落細胞EGFR表達情況及中醫(yī)肝郁分級情況進行了調查，并對兩者之間的關系進行關聯(lián)性研究，旨在探明舌苔變化與肝郁病理的內在聯(lián)系，為中醫(yī)舌診的現(xiàn)代化、客觀化研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年5月-2013年3月在福建省立醫(yī)院就診的圍絕經(jīng)期患者共100例為觀察組，年齡42～58歲，平均（47.11±4.35）歲，病程3.5～9.7個月；對照組為在福建省立醫(yī)院健康體檢中心進行體檢的健康女性30例，年齡41～59歲，平均（48.13±2.81）歲。兩組受試者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05），具有可比性。

1.2 圍絕經(jīng)期綜合征診斷標準及納入、排除標準

1.2.1 診斷標準及納入標準 圍絕經(jīng)期綜合征西醫(yī)診斷標準參照《婦產科學》[2]。觀察組納入標準：符合圍絕經(jīng)期綜合征西醫(yī)診斷標準且未經(jīng)過雌、孕激素替代治療者。對照組納入標準：年齡40～59歲的健康婦女，月經(jīng)周期規(guī)律。所有參與調查者均自愿簽署《知情同意書》。

1.2.2 排除標準 凡不符合圍絕經(jīng)期綜合征納入標準者；乳腺腫瘤、側卵巢切除、卵巢器質性病變、卵巢功能早衰者；原因不明的陰道不規(guī)則出血未治愈者；精神病患者；合并心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重疾病者。

1.3 試驗方法 對所有患者進行四診資料的采集，進行舌苔脫落細胞標本的采集和EGFR的檢測；通過證素辯證計算肝郁積分，并對觀察組患者按肝郁積分進行分級，其具體的方法如下。

1.3.1 四診資料采集 按中醫(yī)傳統(tǒng)四診方法進行資料的收集，將“600種常見癥狀的辨證意義”進行分解制定獲得規(guī)范量表。由經(jīng)過規(guī)范培訓的中醫(yī)專業(yè)人員進行四診資料的采集，盡量確保資料的客觀與準確性[3]。

1.3.2 證素辨證計算肝郁積分 參照“600種常見癥狀的辨證意義”[3]，將臨床表現(xiàn)中屬于肝郁要素的貢獻度進行累積相加并求和，作為肝郁證素積分。積分<70，為0級，說明無肝郁病理改變；70≤積分<100，為1級，說明肝郁病理發(fā)生輕度改變；100≤積分<150，為2級，說明肝郁病理發(fā)生中度改變；積分≥150，為3級，說明肝郁病理發(fā)生重度改變。

1.3.3 舌象診斷 根據(jù)《中醫(yī)診斷學》舌診診斷標準，仔細觀察受試者舌質和舌苔情況。根據(jù)觀察結果，舌質分為淡白、淡紅、紅色、紫色4種，舌苔分為薄白、薄黃、白厚、黃厚4種。將觀察組及對照組的舌質及舌苔情況記錄填寫在專用的臨床觀察表上。

1.3.4 舌苔脫落細胞采集 受試者空腹采集樣本，患者將舌自然伸出，采集者用經(jīng)消毒無菌的牙簽平行于舌面取舌中部舌苔，置于盛有PBS緩沖液的15 mL離心管中，重復取舌苔上皮細胞3次，離心1000 r/min，5 min，收集沉淀，生理鹽水混懸，然后涂片于經(jīng)明膠處理的載玻片上。

1.3.5 舌苔脫落細胞EGFR檢測

1.3.5.1 主要試劑 兔抗人EGFR單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、濃縮型DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京中杉金橋生物技術有限公司）、即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、4%多聚甲醛、H2O2、甲醇。

1.3.5.2 染色方法 涂片經(jīng)4%多聚甲醛固定60～90 min后，雙蒸水洗滌3次。于涂片上滴加30%H2O2甲醇+蒸餾水10份混合液，室溫5～10 min滅活內源酶，雙蒸水洗滌3次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，不洗。滴加兔抗人EGFR一抗，1：100稀釋，4 ℃過夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，滴加SABC，37 ℃ 20 min，每步驟間均用0.01 mol/L PBS洗滌2～5 min，共3次。DAB顯色，室溫避光10 min，雙蒸水充分洗滌。蘇木素輕度復染1 min，DW水洗，干燥后鏡下觀察。

1.3.5.3 觀察 EGFR免疫組化染色的著色部位為細胞膜和細胞漿。在20×10倍鏡下隨機觀察5個視野，記錄陽性細胞率和細胞著色強度值。陽性細胞率為陽性細胞和總計數(shù)細胞總數(shù)的比值。細胞著色強度根據(jù)著色程度進行分級，評分標準為：-（無）、±（淡黃）、+（棕黃）、++（棕褐），分別以1、2、3、4級表示其積分，對每個觀察細胞進行分級，計數(shù)不同等級細胞數(shù)目，并計算各級細胞數(shù)目評分總和值和計數(shù)細胞的比值為細胞著色強度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用One-way ANOVA方差分析，兩因素之間的相關性采用spearman相關分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同舌苔組的舌苔脫落細胞EGFR的表達比較 對照組的細胞著色強度值明顯低于觀察組不同舌苔組（P<0.05）；觀察組中剝胎組細胞著色強度明顯低于其他不同舌苔組（P<0.05）；黃厚胎組、薄黃胎組EGFR的細胞著色強度明顯高于白厚胎組和薄白胎組（P<0.05）。各組EGFR的陽性細胞率比較結果如下：對照組陽性細胞率明顯低于圍絕經(jīng)期不同舌苔組（P<0.05）；剝胎組陽性細胞率明顯低于其他不同舌苔組（P<0.05）；黃厚胎組EGFR的陽性細胞率明顯高于其他各組（P<0.05），見表1。

*與對照組比較，P<0.01；△與剝胎組比較，P<0.05；﹟與白厚胎組、薄白胎組比較，P<0.05；※與黃厚胎組比較，P<0.01

2.2 不同舌質組舌苔脫落細胞EGFR的表達比較 觀察組不同舌質組EGFR的細胞著色強度值、陽性細胞率均高于對照組（P<0.05）；紫色舌質組EGFR的細胞著色強度值明顯高于其他各舌質組（P<0.05）；其余各舌質組細胞著色強度值、陽性細胞率均無明顯差異，見表2。

*與對照組比較，P<0.01；△與紫色舌質組比較，P<0.05

2.3 觀察組EGFR表達與肝郁分級關系 對照組及觀察組肝郁各級陽性細胞率為：對照組30例為（10.12±3.03）%；觀察組肝郁0級27例為（43.74±5.11）%，肝郁1級22例為（47.89±2.14）%，肝郁2級33例為（48.65±3.66）%，肝郁3級18例為（55.86±4.31）%。觀察組舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率伴隨肝郁等級的增加逐漸升高，兩者呈正相關（R=0.375，P=0.000）。

3 討論

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因cerbB1/EGFR基因編碼的Src族跨膜受體酪氨酸蛋白激酶。其主要位于細胞質膜上，當結合配體后二聚化并激活酪氨酸激酶活性，開啟下游細胞信號轉導通路，最終實現(xiàn)信號的跨膜轉導。EGFR的分布十分廣泛，不僅在哺乳動物的上皮細胞、人成纖維細胞、膠質、角質等細胞有表達等，還在多種腫瘤細胞中過度表達[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)腫瘤患者EGFR濃度表達高的組別中，舌苔脫落細胞的直徑明顯增大，反映了EGFR在人體內對細胞分裂增殖有一定的促進作用[1]。

舌苔，是由于胃氣蒸騰，脾濕上潮于舌所產生的一層位于舌體表面的苔狀物[7]。當舌上皮細胞代謝旺盛時，角化層細胞脫落及時，則表現(xiàn)為正常的薄潤舌苔。當由于生理性、病理性原因所導致的代謝異常情況發(fā)生時，角化層細胞會發(fā)生不完全角化或延遲脫落，舌象上則表現(xiàn)為異常厚苔。有學者發(fā)現(xiàn)健康薄白苔組和病理薄白苔組其舌面pH值呈中性或弱堿性，而病理厚苔組和剝落苔組則呈弱酸性。舌上皮細胞的增殖、分化、凋亡對于正常舌苔的形成并維持正常的生理學功能中發(fā)揮了重要作用，舌上皮細胞的異常增殖、分化、凋亡是影響舌苔變化的重要因素[8-9]。

本實驗表明，圍絕經(jīng)期綜合征患者舌苔脫落細胞EGFR細胞著色強度值及陽性率顯著高于對照組，圍絕經(jīng)期患者舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率與肝郁病理分級呈正相關，說明圍絕經(jīng)期患者舌苔脫落細胞EGFR的表達可以作為判斷肝郁病變程度的重要參考。在今后的研究中，可以繼續(xù)從基因、蛋白水平進行其相關性的研究，為進一步探討舌苔變化與肝郁病理的關聯(lián)，揭示舌苔的形成機制，為中醫(yī)舌診的臨床研究提供理論參考。

參考文獻

[1]侯亮，王瑞平，詹瑧，等.消化系統(tǒng)腫瘤患者舌苔脫落細胞EGFR表達及唾液EGFR含量研究[J].南京中醫(yī)藥大學學報（自然科學版），2003，5（19）：141-143.

[2]樂杰.婦產科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：350-351.

[3]朱文鋒.證素辨證學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：36-77.

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[6] Scagliotti G V，Selvaggi G，Novello S，et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer[J].Clinical Cancer Research，2004，10（2）：4227-4232.

[7]李燦東，高碧珍，蘭啟防，等.原發(fā)性不孕癥舌印片與陰道脫落細胞的對照觀察[J].福建中醫(yī)藥大學學報，2004，14（2）：3-6.

[8]吳正治，郭振球，李新華，等.七種常見舌苔的細胞化學計量診斷研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，1996，19（3）：57.

[9] Ahmed M M.Expression profile of apoptotic mediators and proliferative markers in oral squamous cell carcinoma[J].J Egypt Natl Canc Inst，2009，21（2）：85-92.

（收稿日期：2013-09-16） （本文編輯：蔡元元）

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用One-way ANOVA方差分析，兩因素之間的相關性采用spearman相關分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同舌苔組的舌苔脫落細胞EGFR的表達比較 對照組的細胞著色強度值明顯低于觀察組不同舌苔組（P<0.05）；觀察組中剝胎組細胞著色強度明顯低于其他不同舌苔組（P<0.05）；黃厚胎組、薄黃胎組EGFR的細胞著色強度明顯高于白厚胎組和薄白胎組（P<0.05）。各組EGFR的陽性細胞率比較結果如下：對照組陽性細胞率明顯低于圍絕經(jīng)期不同舌苔組（P<0.05）；剝胎組陽性細胞率明顯低于其他不同舌苔組（P<0.05）；黃厚胎組EGFR的陽性細胞率明顯高于其他各組（P<0.05），見表1。

*與對照組比較，P<0.01；△與剝胎組比較，P<0.05；﹟與白厚胎組、薄白胎組比較，P<0.05；※與黃厚胎組比較，P<0.01

2.2 不同舌質組舌苔脫落細胞EGFR的表達比較 觀察組不同舌質組EGFR的細胞著色強度值、陽性細胞率均高于對照組（P<0.05）；紫色舌質組EGFR的細胞著色強度值明顯高于其他各舌質組（P<0.05）；其余各舌質組細胞著色強度值、陽性細胞率均無明顯差異，見表2。

*與對照組比較，P<0.01；△與紫色舌質組比較，P<0.05

2.3 觀察組EGFR表達與肝郁分級關系 對照組及觀察組肝郁各級陽性細胞率為：對照組30例為（10.12±3.03）%；觀察組肝郁0級27例為（43.74±5.11）%，肝郁1級22例為（47.89±2.14）%，肝郁2級33例為（48.65±3.66）%，肝郁3級18例為（55.86±4.31）%。觀察組舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率伴隨肝郁等級的增加逐漸升高，兩者呈正相關（R=0.375，P=0.000）。

3 討論

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因cerbB1/EGFR基因編碼的Src族跨膜受體酪氨酸蛋白激酶。其主要位于細胞質膜上，當結合配體后二聚化并激活酪氨酸激酶活性，開啟下游細胞信號轉導通路，最終實現(xiàn)信號的跨膜轉導。EGFR的分布十分廣泛，不僅在哺乳動物的上皮細胞、人成纖維細胞、膠質、角質等細胞有表達等，還在多種腫瘤細胞中過度表達[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)腫瘤患者EGFR濃度表達高的組別中，舌苔脫落細胞的直徑明顯增大，反映了EGFR在人體內對細胞分裂增殖有一定的促進作用[1]。

舌苔，是由于胃氣蒸騰，脾濕上潮于舌所產生的一層位于舌體表面的苔狀物[7]。當舌上皮細胞代謝旺盛時，角化層細胞脫落及時，則表現(xiàn)為正常的薄潤舌苔。當由于生理性、病理性原因所導致的代謝異常情況發(fā)生時，角化層細胞會發(fā)生不完全角化或延遲脫落，舌象上則表現(xiàn)為異常厚苔。有學者發(fā)現(xiàn)健康薄白苔組和病理薄白苔組其舌面pH值呈中性或弱堿性，而病理厚苔組和剝落苔組則呈弱酸性。舌上皮細胞的增殖、分化、凋亡對于正常舌苔的形成并維持正常的生理學功能中發(fā)揮了重要作用，舌上皮細胞的異常增殖、分化、凋亡是影響舌苔變化的重要因素[8-9]。

本實驗表明，圍絕經(jīng)期綜合征患者舌苔脫落細胞EGFR細胞著色強度值及陽性率顯著高于對照組，圍絕經(jīng)期患者舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率與肝郁病理分級呈正相關，說明圍絕經(jīng)期患者舌苔脫落細胞EGFR的表達可以作為判斷肝郁病變程度的重要參考。在今后的研究中，可以繼續(xù)從基因、蛋白水平進行其相關性的研究，為進一步探討舌苔變化與肝郁病理的關聯(lián)，揭示舌苔的形成機制，為中醫(yī)舌診的臨床研究提供理論參考。

參考文獻

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[8]吳正治，郭振球，李新華，等.七種常見舌苔的細胞化學計量診斷研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，1996，19（3）：57.

[9] Ahmed M M.Expression profile of apoptotic mediators and proliferative markers in oral squamous cell carcinoma[J].J Egypt Natl Canc Inst，2009，21（2）：85-92.

（收稿日期：2013-09-16） （本文編輯：蔡元元）

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用One-way ANOVA方差分析，兩因素之間的相關性采用spearman相關分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同舌苔組的舌苔脫落細胞EGFR的表達比較 對照組的細胞著色強度值明顯低于觀察組不同舌苔組（P<0.05）；觀察組中剝胎組細胞著色強度明顯低于其他不同舌苔組（P<0.05）；黃厚胎組、薄黃胎組EGFR的細胞著色強度明顯高于白厚胎組和薄白胎組（P<0.05）。各組EGFR的陽性細胞率比較結果如下：對照組陽性細胞率明顯低于圍絕經(jīng)期不同舌苔組（P<0.05）；剝胎組陽性細胞率明顯低于其他不同舌苔組（P<0.05）；黃厚胎組EGFR的陽性細胞率明顯高于其他各組（P<0.05），見表1。

*與對照組比較，P<0.01；△與剝胎組比較，P<0.05；﹟與白厚胎組、薄白胎組比較，P<0.05；※與黃厚胎組比較，P<0.01

2.2 不同舌質組舌苔脫落細胞EGFR的表達比較 觀察組不同舌質組EGFR的細胞著色強度值、陽性細胞率均高于對照組（P<0.05）；紫色舌質組EGFR的細胞著色強度值明顯高于其他各舌質組（P<0.05）；其余各舌質組細胞著色強度值、陽性細胞率均無明顯差異，見表2。

*與對照組比較，P<0.01；△與紫色舌質組比較，P<0.05

2.3 觀察組EGFR表達與肝郁分級關系 對照組及觀察組肝郁各級陽性細胞率為：對照組30例為（10.12±3.03）%；觀察組肝郁0級27例為（43.74±5.11）%，肝郁1級22例為（47.89±2.14）%，肝郁2級33例為（48.65±3.66）%，肝郁3級18例為（55.86±4.31）%。觀察組舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率伴隨肝郁等級的增加逐漸升高，兩者呈正相關（R=0.375，P=0.000）。

3 討論

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因cerbB1/EGFR基因編碼的Src族跨膜受體酪氨酸蛋白激酶。其主要位于細胞質膜上，當結合配體后二聚化并激活酪氨酸激酶活性，開啟下游細胞信號轉導通路，最終實現(xiàn)信號的跨膜轉導。EGFR的分布十分廣泛，不僅在哺乳動物的上皮細胞、人成纖維細胞、膠質、角質等細胞有表達等，還在多種腫瘤細胞中過度表達[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)腫瘤患者EGFR濃度表達高的組別中，舌苔脫落細胞的直徑明顯增大，反映了EGFR在人體內對細胞分裂增殖有一定的促進作用[1]。

舌苔，是由于胃氣蒸騰，脾濕上潮于舌所產生的一層位于舌體表面的苔狀物[7]。當舌上皮細胞代謝旺盛時，角化層細胞脫落及時，則表現(xiàn)為正常的薄潤舌苔。當由于生理性、病理性原因所導致的代謝異常情況發(fā)生時，角化層細胞會發(fā)生不完全角化或延遲脫落，舌象上則表現(xiàn)為異常厚苔。有學者發(fā)現(xiàn)健康薄白苔組和病理薄白苔組其舌面pH值呈中性或弱堿性，而病理厚苔組和剝落苔組則呈弱酸性。舌上皮細胞的增殖、分化、凋亡對于正常舌苔的形成并維持正常的生理學功能中發(fā)揮了重要作用，舌上皮細胞的異常增殖、分化、凋亡是影響舌苔變化的重要因素[8-9]。

本實驗表明，圍絕經(jīng)期綜合征患者舌苔脫落細胞EGFR細胞著色強度值及陽性率顯著高于對照組，圍絕經(jīng)期患者舌苔脫落細胞EGFR表達陽性率與肝郁病理分級呈正相關，說明圍絕經(jīng)期患者舌苔脫落細胞EGFR的表達可以作為判斷肝郁病變程度的重要參考。在今后的研究中，可以繼續(xù)從基因、蛋白水平進行其相關性的研究，為進一步探討舌苔變化與肝郁病理的關聯(lián)，揭示舌苔的形成機制，為中醫(yī)舌診的臨床研究提供理論參考。

參考文獻

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[9] Ahmed M M.Expression profile of apoptotic mediators and proliferative markers in oral squamous cell carcinoma[J].J Egypt Natl Canc Inst，2009，21（2）：85-92.

（收稿日期：2013-09-16） （本文編輯：蔡元元）