難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF—1α與多藥耐藥基因1表達(dá)的相關(guān)性及其意義

王廣新等

【摘要】 目的：探討難治性癲癇患者腦內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）與多藥耐藥基因1（MDR1）的表達(dá)情況、相關(guān)性及其意義。方法：收集9例難治性癲癇組手術(shù)切除腦組織標(biāo)本及7例對(duì)照組腦組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)HIF-1α和MDR1的表達(dá)情況，并分析HIF-1α與MDR1表達(dá)陽(yáng)性率的相關(guān)性。結(jié)果：HIF-1α在難治性癲癇組腦組織中的陽(yáng)性表達(dá)率77.8%（7/9）明顯高于對(duì)照組的14.3%（1/7）；MDR1在難治性癲癇組腦組織中的陽(yáng)性表達(dá)率66.7%（6/9）明顯高于對(duì)照組的14.3%（1/7），比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；難治性癲癇組腦組織中HIF-1α與MDR1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.76，P<0.05）。結(jié)論：難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF-1α和MDR1表達(dá)升高，且兩者呈正相關(guān)。HIF-1α可能通過調(diào)控MDR1基因表達(dá)而參與難治性癲癇的形成。

【關(guān)鍵詞】 缺氧誘導(dǎo)因子1α； 多藥耐藥基因1； 難治性癲癇

癲癇是一組由大量神經(jīng)元反復(fù)發(fā)作的異常放電而引起的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)短暫性功能失常為特征的慢性腦部疾病。70%～80%癲癇患者經(jīng)系統(tǒng)、正規(guī)應(yīng)用抗癲癇藥治療可獲得長(zhǎng)期緩解，其余20%～30%患者的發(fā)作不能得到有效控制，成為難治性癲癇（refractory epilepsy，RE）或稱耐藥性癲癇[1]。難治性癲癇的形成原因復(fù)雜，涉及多種因素，如遺傳因素；多種癲癇發(fā)作類并存，某些癲癇類型如嬰兒痙攣癥、腦部器質(zhì)性病變等[2]。多藥耐藥基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）作為人體內(nèi)主要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的編碼基因，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)與難治性癲癇有關(guān)的基因，該基因的高表達(dá)是難治性癲癇形成的重要生物學(xué)基礎(chǔ)。目前，難治性癲癇腦組織中MDR1高表達(dá)的機(jī)制研究廣受關(guān)注，如有研究發(fā)現(xiàn)MDR1基因的多態(tài)性可引起MDR1表達(dá)異常；還有研究者認(rèn)為癇性發(fā)作本身也可引起P-gp表達(dá)升高。但是。從MDR1基因的調(diào)控通路角度探討P-gp升高的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)在MDR1基因啟動(dòng)子上存在功能性的缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia induced factor 1α，HIF-1α）結(jié)合位點(diǎn)，缺氧時(shí)，HIF-1α可通過調(diào)控MDR1基因誘導(dǎo)MDR1/P-gp的表達(dá)增加[3]。由于癲癇發(fā)作時(shí)出現(xiàn)大量神經(jīng)元的異常放電，耗氧量增加，存在大腦局部微環(huán)境缺氧。但是，難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF-1α和MDR1的表達(dá)情況及兩者的聯(lián)系有待研究。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)難治性癲癇患者腦組織中HIF-1α和MDR1的表達(dá)情況，分析HIF-1α與MDR1表達(dá)陽(yáng)性率的相關(guān)性，以期在體探討HIF-1α在難治性癲癇發(fā)生機(jī)制中的作用，為難治性癲癇治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科診斷為難治性癲癇且進(jìn)行手術(shù)治療的9例患者作為難治性癲癇組，所有患者均符合吳遜、沈鼎烈等（1998）提出的標(biāo)準(zhǔn)，其中男5例，女4例，平均（39.56±13.56）歲，癲癇病史4～13年，發(fā)作類型為：復(fù)雜部分性發(fā)作3例，復(fù)雜部分性發(fā)作繼發(fā)全部性發(fā)作2例，強(qiáng)直-陣攣發(fā)作1例，陣攣性發(fā)作2例，失神發(fā)作1例。同時(shí)另選取7例非癲癇患者作為對(duì)照組，其中男5例，女2例，平均（35.71±12.24）歲，腦血管畸形4例，腦外傷手術(shù)3例，入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）無癲癇或熱性驚厥等病史；（2）無腫瘤病史；（3）無陽(yáng)性癲癇家族史；（4）無其他嚴(yán)重的慢性神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性疾病等。以上受試對(duì)象均對(duì)本研究簽署知情同意書。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器 Mdr-1小鼠抗人單克隆抗體、HIF-1α小鼠抗人單克隆抗體（santa cruz）；免疫組化染色試劑盒SP-9002（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；光學(xué)顯微鏡Olympus CH-20（Olympus）；數(shù)顯恒溫水浴箱（江蘇省常州國(guó)華公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化 受試對(duì)象手術(shù)后立即取其大腦組織標(biāo)本，其中難治性癲癇組腦組織的取材部位盡量在癲癇波異常放電的中心區(qū)。所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，采用SP-9002免疫組化染色試劑盒行免疫組織化學(xué)染色，操作按照說明書要求進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) HIF-1α和MDR1陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿中出現(xiàn)清晰棕褐色顆粒為準(zhǔn)，采用半定量評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行判定。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]的判斷方法如下：每例均高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果，陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞>75%為4分。陽(yáng)性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中度陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），（-）界定為陰性表達(dá)，（+）～（+++）判為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 11.0 for Windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Mann-Whitney 秩檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，相關(guān)研究采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腦組織中HIF-1α的表達(dá)比較 兩組腦組織中HIF-1α陽(yáng)性染色呈彌漫分布，主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，見圖1。HIF-1α在難治性癲癇組腦組織中的陽(yáng)性表達(dá)率77.8%（7/9）明顯高于對(duì)照組的14.3%（1/7），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.35，P<0.05）。

注：陽(yáng)性細(xì)胞為棕褐色

2.2 兩組腦組織中MDR1的表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示MDR1陽(yáng)性染色在兩組腦組織中主要定位于細(xì)胞胞漿及細(xì)胞膜中，見圖2。難治性癲癇組腦組織MDR1陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%（6/9），對(duì)照組腦組織陽(yáng)性表達(dá)率為14.3%（1/7），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.39，P<0.05）。

注：陽(yáng)性細(xì)胞為棕褐色

2.3 難治性癲癇組腦組織中HIF-1α和MDR1陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，HIF-1α和MDR1在難治性癲癇組腦組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.76），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=5.14，P=0.02），見表1。

3 討論

難治性癲癇是最棘手的臨床問題之一，其發(fā)生機(jī)制至今尚未完全明確。癲癇的長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，不僅使患者不斷遭受軀體痛苦，而且在一定程度上導(dǎo)致患者心理障礙及引起一系列社會(huì)問題[5]。目前難治性癲癇的治療方法有使用新型抗癲癇藥及手術(shù)治療等，但效果均不佳或手術(shù)存在后遺癥。因此，闡明難治性癲癇的耐藥機(jī)制，尋找新的藥物靶點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外癲癇工作者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

目前認(rèn)為MDR1的高表達(dá)是難治性癲癇發(fā)生的重要基礎(chǔ)[6]。但是，難治性癲癇患者M(jìn)DR1高表達(dá)的分子機(jī)制是什么？至今尚未明了，這是本項(xiàng)目研究的切入點(diǎn)。從基因表達(dá)調(diào)控的角度探討難治性癲癇的形成機(jī)制將是未來難治性癲癇研究的重要發(fā)展方向。近年來，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）對(duì)MDR1基因的調(diào)控作用受到人們的關(guān)注。1992年Semenza和Wallg在低氧的肝癌細(xì)胞株HeP3B細(xì)胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)一種蛋白特異性地結(jié)合于紅細(xì)胞生成素（EPO）基因增強(qiáng)子的寡核苷酸序列，命名為缺HIF-l。HIF-1由缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，是唯一在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，它由α和β兩種亞基聚合而成，其中HIF-1β是結(jié)構(gòu)性亞基，不論低氧或是常氧，它的mRNA和蛋白表達(dá)水平都保持在一個(gè)恒定水平；HIF-1α是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，它決定HIF-1的活性，氧對(duì)HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過該亞基，它的cDNA全長(zhǎng)為3720 bp，開放閱讀框2478 bp，位于14號(hào)染色體（14q21-q24），編碼826個(gè)氨基酸。HIF-lα是主要的調(diào)節(jié)及活性亞基，由氧濃度嚴(yán)格調(diào)控，常氧下，通過泛素-蛋白酶體途徑被迅速降解，表達(dá)量少；而在低氧條件下，HIF-lα的泛素化和降解過程受抑制，在胞內(nèi)積聚、穩(wěn)定并轉(zhuǎn)位，由胞漿進(jìn)入胞核，在胞核內(nèi)與HIF-1β形成二聚體，HIF復(fù)合體形成后即轉(zhuǎn)錄激活，激活的HIF復(fù)合體與缺氧反應(yīng)基因的缺氧反應(yīng)元件低氧反應(yīng)元件（hypoxic response element，HRE）上的HIF-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因如MDR1、p53的轉(zhuǎn)錄，引發(fā)細(xì)胞對(duì)缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)[7-8]。Wartenberg等[9]在體外研究中發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境可上調(diào)P-gp表達(dá)，且需要HIF-1α的參與，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在MDR1基因啟動(dòng)子上存在功能性的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)，缺氧時(shí)，HIF-1α可通過調(diào)控MDR1基因誘導(dǎo)MDR1/P-gp的表達(dá)增加[10-11]。另外，有研究者在乳腺癌細(xì)胞采用反義寡核苷酸封閉HIF-1α表達(dá)后，可明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的MDR1表達(dá)，這些證據(jù)顯示，人體內(nèi)在缺氧環(huán)境下存在HIF-1α對(duì)MDR1基因表達(dá)調(diào)控的通路。

由于癲癇發(fā)作時(shí)出現(xiàn)大量神經(jīng)元的異常放電，則會(huì)伴有能量消耗，耗氧量也就增加，另外，難治性癲癇腦組織中存在與腦缺氧缺血性疾病一致的病理改變，如神經(jīng)元退行性損傷和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，因此，難治性癲癇存在大腦局部微環(huán)境缺氧是明確的[11]。本課題假定癲癇發(fā)作→缺氧→HIF-1α的產(chǎn)生→MDR1基因表達(dá)→P-gp上調(diào)→大腦細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降→耐藥這一連串變化參與了難治性癲癇的形成。

本研究收集了難治性癲癇組手術(shù)切除腦組織標(biāo)本及對(duì)照組腦組織標(biāo)本，通過在體研究，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)難治性癲癇患者腦組織HIF-1α和MDR1的表達(dá)情況，并分析了HIF-1α和MDR1表達(dá)陽(yáng)性率的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HIF-1α在難治性癲癇組腦組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；MDR1表達(dá)產(chǎn)物P-gp在難治性癲癇組腦組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；難治性癲癇組腦組織中HIF-1α與MDR1表達(dá)產(chǎn)物P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.76）。

總之，本研究得出的初步結(jié)論是：難治性癲癇患者腦內(nèi)HIF-1α與MDR1高表達(dá)相關(guān)；HIF-1α可能通過調(diào)控MDR1基因表達(dá)而參與難治性癲癇的形成；HIF-1α可能是難治性癲癇治療的新靶點(diǎn)。但是，由于對(duì)難治性癲癇的手術(shù)治療存在偏見，我省開展的難治性癲癇手術(shù)治療病例較少，因此獲取大量的難治性癲癇患者腦組織標(biāo)本較困難，本課題僅對(duì)9例難治性癲癇組患者進(jìn)行研究，樣本量小，是本研究的不足之處，有待擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步研究，也有待于進(jìn)一步開展難治性癲癇的動(dòng)物模型、細(xì)胞膜型研究，以驗(yàn)證本研究得出的初步結(jié)論。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2013-12-16） （本文編輯：歐麗）

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（收稿日期：2013-12-16） （本文編輯：歐麗）