無血清誘導脂肪間充質(zhì)干細胞向雪旺細胞分化的實驗研究

張秀霞，蔣良福

(1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院急診科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院手外科，浙江 溫州 325027)

雪旺細胞作為周圍神經(jīng)組織工程的種子細胞在周圍神經(jīng)再生中的重要作用已被廣泛證實，誘導間充質(zhì)干細胞向雪旺細胞的分化是目前研究的熱點，已有從骨髓基質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞誘導轉(zhuǎn)化為雪旺細胞的報道[1，2]。將誘導后的雪旺細胞作為種子細胞移植入的是一個無血管供血的體內(nèi)環(huán)境。本實驗將模擬體內(nèi)環(huán)境，探討在無血清培養(yǎng)下將脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成雪旺細胞的可行性，為以后的脂肪間充質(zhì)干細胞向雪旺細胞的體內(nèi)誘導分化提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 近交系SD大鼠10只，清潔級，體重180～200g，2月齡，雌雄不限，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 0.1%Ⅰ型膠原酶(sigma，美國)，10%胎牛血清(碧云天公司，杭州)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)，100X青鏈霉素，β-巰基乙醇(sigma，美國)，全反式維甲酸(sigma，美國)，forskolin(Peprotech，英國)，堿式成纖維生長因子(basic fibrgblast growth factor，bFGF，Peprotech，英國)，血小板源性衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF，Peprotech，英國)，神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(glial growth factor，GGF，Peprotech，英國)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng) 采用Zuk等[3]的方法分離大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞并培養(yǎng)。2個月齡SD大鼠麻醉后取雙側(cè)睪丸周圍脂肪組織，去除肉眼可見血管以及結(jié)

基金項目：浙江省自然科學基金資助(Y2100253)；溫州市科技計劃項目(Y20130203)；*本文通訊作者：蔣良福

締組織，剪成約1 cm×1 cm×1 cm大小，0.1%Ⅰ型膠原酶震蕩消化60 min，等體積DMEM/F12終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀用含15%胎牛血清的DMEM/F12重懸并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。48 h換液去除未貼壁細胞，每3天換液。取第三代脂肪間充質(zhì)干細胞行倒置顯微鏡形態(tài)學觀察、CD44、CD90和CD45流式細胞儀鑒定細胞表面標志

1.2.2 分組 將第3代大鼠脂肪干細胞分為實驗組及對照組，實驗組予無血清培養(yǎng)基(100%DMEM/F12)誘導培養(yǎng)，對照組繼續(xù)DMEM/F12完全培養(yǎng)基(90DMEM/F12+體積分數(shù)10%FBS)誘導培養(yǎng)。

1.2.3 大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞向雪旺細胞誘導方法 將2組細胞消化計數(shù)，吹打分散成單個細胞懸液后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，24 h后分別加入含1 mmol/Lβ-巰基乙醇的培養(yǎng)基，24 h后PBS清洗，加入含40 ng/mL全反式維甲酸的培養(yǎng)基，培育72 h去除培養(yǎng)基，PBS清洗，加入含5 ng/mL PDFG，10 ng/mL bFGF，14 μmol/L forsklin，200 ng/mL GGF的培養(yǎng)基中培育2周，期間3天換液一次。

1.3 觀察指標 脂肪間充質(zhì)干細胞倒置顯微鏡下形態(tài)學觀察。脂肪間充質(zhì)干細胞CD90和CD44、CD45流式鑒定。誘導形態(tài)觀察：誘導后2周倒置顯微鏡下觀察誘導脂肪間充質(zhì)干細胞形態(tài)學變化。S-100和GFAP免疫熒光細胞化學染色：誘導脂肪間充質(zhì)干細胞誘導后細胞爬片，鋪滿后4%多聚甲醛固定，各組細胞封閉、一抗、二抗孵育，封片后倒置熒光顯微鏡下觀察并計算陽性率。

2 結(jié) 果

原代脂肪間充質(zhì)干細胞呈成纖維樣細胞，貼壁生長。流式細胞儀鑒定細胞表面標記，間充質(zhì)干細胞相關(guān)的CD90和CD44表達陽性，而造血細胞相關(guān)的CD45表達陰性(見圖1～3)。2組第三代脂肪間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導后，大部分細胞成梭形，長出兩極突起，突起帶有光暈，各相鄰細胞突起之間相互連接，成樹杈狀排列(圖4～5)。經(jīng)S-100和GFAP免疫熒光染色后，2組大量細胞的S-100和GFAP免疫熒光細胞染色陽性，實驗組S-100陽性率(82.1±5.31)%，對照組S-100陽性率(79.15±6.38)%，比較無明顯差異(P>0.05)，實驗組GFAP陽性率(78.39±6.92)%，對照組GFAP陽性率(80.51±3.29)%，比較無明顯差異(P>0.05)，(見圖6～9)。

3 討 論

雪旺細胞具有營養(yǎng)神經(jīng)、趨化和使周圍神經(jīng)再生軸突成熟的重要功能，在修復(fù)周圍神經(jīng)缺失的過程中具有重要的作用。脂肪間充質(zhì)干細胞是近年來較熱門的種子細胞，人體脂肪組織含量豐富，容易提取，且大量研究表明脂肪間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能[4，5]。國內(nèi)外學者都曾報道了將脂肪間充質(zhì)干細胞誘導成雪旺細胞的研究。但目前沒有模擬移植初期體內(nèi)的缺血環(huán)境，因此本實驗用無血清的培養(yǎng)基模擬體內(nèi)的缺血環(huán)境，將脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化為雪旺細胞。

圖1 CD90流式細胞表型鑒定陽性

圖2 CD44流式細胞表型鑒定陽性

圖3 CD45流式細胞表型鑒定陰性

圖4 倒置顯微鏡下無血清培養(yǎng)誘導后雪旺細胞(×100)

圖5 倒置顯微鏡下含血清培養(yǎng)誘導后雪旺細胞(×100)

圖6 試驗組S-100細胞免疫熒光(×100)

圖7 對照組S-100細胞免疫熒光(×100)

圖8 試驗組GFAP細胞免疫熒光(×100)

雪旺細胞來源于神經(jīng)嵴細胞，再由神經(jīng)嵴細胞經(jīng)雪旺細胞前體、未成熟的雪旺細胞，最后發(fā)育為神經(jīng)細胞。β-巰基乙醇能提高細胞內(nèi)的c-AMP水平，適量濃度的β-巰基乙醇可以促進間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化[6]，全反式維甲酸能促進早期的神經(jīng)細胞向神經(jīng)嵴細胞分化，同時能促進細胞有絲分裂[7，8]。PDFG，bFGF，forsklin，GGF是可以促進神經(jīng)細胞向周圍神經(jīng)分化以及成熟，并提高對神經(jīng)營養(yǎng)因子的應(yīng)答的細胞因子，在使用全反式維甲酸誘導脂肪間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞后，應(yīng)用PDFG，bFGF，forskllin，GGF，細胞體形更加兩極化，并出現(xiàn)光暈，成樹杈狀排列，符合雪旺細胞的形態(tài)學改變。

圖9 對照組GFAP細胞免疫熒光(×100)

S100和GFAP是雪旺細胞富含的蛋白，是鑒定雪旺細胞的常用指標。本實驗在無血清培養(yǎng)條件下，采用逐步誘導的方法，將脂肪間充質(zhì)干細胞逐步誘導為雪旺細胞。經(jīng)細胞免疫熒光鑒定符合雪旺細胞特性，與血清培養(yǎng)條件下比較，在形態(tài)學和細胞免疫熒光鑒定陽性率無明顯差異。

脂肪間充質(zhì)干細胞在無血清培養(yǎng)條件下，能定向誘導分化為雪旺細胞。

參考文獻：

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