壽光市某犬瘟熱病毒的分離鑒定及其致病性

李志松 （山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局 262700）

李志杰 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊） 王海燕 （山東省壽光市紀(jì)臺(tái)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)管理站）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus, CDV)引起的犬科動(dòng)物的一種高度接觸性和致死性傳染病，發(fā)病率和死亡率都非常高[1,2,3,4]。臨床上多以雙相熱、神經(jīng)癥狀、結(jié)膜炎、鼻炎、支氣管炎、肺炎、胃腸炎等為主要特征，嚴(yán)重影響?zhàn)B犬業(yè)的發(fā)展，并可能對(duì)多種毛皮動(dòng)物以及珍稀動(dòng)物熊貓、虎等的生命安全構(gòu)成威脅[5,6,7]。CDV自1809年首次報(bào)道以來，目前已遍及全球，我國1980年首次分離到該病毒。近年來，犬瘟熱在我國犬中的發(fā)病率和致死率有明顯升高的趨勢(shì)，其危害也日趨嚴(yán)重。開展犬瘟熱流行病學(xué)的調(diào)查并對(duì)其致病性做系統(tǒng)研究為科學(xué)防制CDV具有重要意義。本研究從壽光市某病例中分離鑒定了一株CVD并對(duì)其致病性做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒的分離鑒定 Vero細(xì)胞由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院保存，其生長(zhǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM (pH7.2)，細(xì)胞維持液為含2%胎牛血清的DMEM(PH7.2)。病料來源于壽光市某動(dòng)物門診，經(jīng)診斷試紙確診為感染犬瘟熱，采集死亡犬的肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等器官組織一部分保存于-80℃?zhèn)溆茫Ｓ嘟M織剪碎研磨后與PBS緩沖液以1:10混合，反復(fù)凍融3次，于5000r/min在4℃下離心10min，取上清液，再放入離心機(jī)以12000r/min在4℃下離心20min。取上清液以0.22ul濾器過濾后接種于Vero細(xì)胞培養(yǎng)，37℃2h后換為維持液，同時(shí)設(shè)有空白細(xì)胞對(duì)照組。將出現(xiàn)病變的細(xì)胞培養(yǎng)液、CDV陽性血清和無血清培養(yǎng)物進(jìn)行雙向瓊脂擴(kuò)散，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，將出現(xiàn)穩(wěn)定病變的病毒以終點(diǎn)稀釋法將病毒液(第4代)按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋接種于24孔板，每個(gè)梯度重復(fù)3孔，收集病變的細(xì)胞孔培養(yǎng)液，凍融3次后再接種細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 分離病毒的理化特性測(cè)定 將初步培養(yǎng)純化的病毒接種Vero細(xì)胞后9d收獲病毒，凍融3次后在4℃下12000r/min離心15min，取上清液保存于-80℃冰箱中。將病毒液的pH調(diào)至9.0后在37℃下作用2h，再用0.5%HCI調(diào)節(jié)pH至7.2左右，每孔加入100μl的DEME(2%FBS，pH7.4)作10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，于37℃下培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變以判斷病毒的耐堿性。將病毒液用0.5%HCI調(diào)pH至4.5，37℃作用2h后，再用1.4% NaHCO3調(diào)pH到7.2左右，其余操作同上，確定病毒的耐酸特性。將病毒液稀釋至10-6，56℃下作用30min后，接種新長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的96孔板，每個(gè)梯度12孔，并在37℃下培養(yǎng)觀察，同時(shí)設(shè)有對(duì)照組。

1.3 分離病毒的血凝性測(cè)定 將病毒液做倍比稀釋至1:640后分別吸取25μl滴加于96孔V型板中，依次加入25μl生理鹽水和50μl 1%雞紅細(xì)胞混勻，于4℃和37℃下作用1-2h后觀察血凝性，并設(shè)對(duì)照孔。按同樣的方法，觀察病毒對(duì)綿羊和兔子紅細(xì)胞的血凝性。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：++++：為100%凝集，紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，呈傘狀或荷葉狀卷邊。+++：為75%凝集，與上基本相同，但邊緣有少量紅細(xì)胞小凝塊。++：為50%凝集，紅細(xì)胞呈圓盤狀沉于孔底，周圍有明顯小凝塊。+：為25%凝集，紅細(xì)胞沉于孔底，周圍有少量小凝塊。-：為不凝集，紅細(xì)胞沉于孔底，呈圓點(diǎn)狀。

1.4 分離病毒的TCID50測(cè)定 在經(jīng)胰酶消化后長(zhǎng)滿的單層Vero細(xì)胞中加入含10%FBS的DMEM充分吹打均勻，放置于37℃培養(yǎng)，取100μl經(jīng)10倍梯度稀釋的病毒液進(jìn)加入上述長(zhǎng)成的單層細(xì)胞中，并設(shè)定對(duì)照，在37℃吸附1h后補(bǔ)足營養(yǎng)液并培養(yǎng)。逐日觀察記錄病變至10d后，按照Reed-Muech法計(jì)算分離病毒的TCID50。按照同樣的方法計(jì)算接毒細(xì)胞在2d、4d、7d、9d和12d的TCID50。

1.5 分離病毒的致病性試驗(yàn) 選1月齡未免疫經(jīng)診斷為陰性的健康幼犬8只，分為4組，每組2只，隔離飼養(yǎng)。第1-3組為試驗(yàn)組，分別注射滴度為1×105.0TCID50、3×105.0TCID50、6×105.0TCID50病毒液1ml，第4組為空白對(duì)照組。接毒后每日測(cè)體溫2次并觀察臨床癥狀，出現(xiàn)癥狀并死亡后立即采集肺臟、肝臟和脾臟，浸泡于10%的甲醛中，用于病理切片，同時(shí)取膀胱粘膜上皮細(xì)胞，自然干燥后用甲醇固定3min，蘇木精染色20min，0.1%伊紅染5min，干燥后檢查包涵體，同時(shí)檢測(cè)發(fā)病犬的眼睛和鼻中漿性分泌物。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離培養(yǎng) 將病毒液接種于Vero細(xì)胞上，在37℃培養(yǎng)下約第5d開始出現(xiàn)CPE，細(xì)胞逐漸圓縮、折光性增強(qiáng)，第6-7d的CPE范圍擴(kuò)大，呈現(xiàn)空泡化，第8d開始出現(xiàn)細(xì)胞拉網(wǎng)脫落，第9-11d細(xì)胞出現(xiàn)大面積拉網(wǎng)脫落。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)表明，分離毒株與CDV陽性血清呈清晰的沉淀帶，為強(qiáng)陽性，將該毒株定名為CDV-sg株。

2.2 分離病毒的理化特性 CDV-sg株在pH7.0～8.0下病毒活性不受影響，而pH6.0以下和pH9.0以上病毒活力受到一定影響，說明CDV-sg較耐酸堿，但是過酸過堿均不利于病毒的生長(zhǎng)。該試驗(yàn)接種CDV-sg株病毒液在56℃下作用30min的細(xì)胞均未出現(xiàn)CPE，而未處理的細(xì)胞觀察10d發(fā)現(xiàn)各稀釋度的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的CPE，可知CDV-sg株對(duì)溫度敏感，30min就可將其滅活。

附表 不同pH值病毒的活力

2.4 分離病毒的血凝試驗(yàn) 雞、兔、綿羊紅細(xì)胞與各稀釋度的CDV-sg病毒液與在37℃分別作用1-2h，紅細(xì)胞均沉于孔底，呈圓點(diǎn)狀，表明CDV-sg對(duì)雞、兔、綿羊紅細(xì)胞等均具備有血凝性。

2.5 分離毒株的致病性試驗(yàn) 接種6×105.0TCID50的2只犬臨床癥狀明顯，第4～7d出現(xiàn)體溫呈雙相熱、-食欲廢絕、眼角有膿性分泌物，最終衰竭死亡，其中一只病死犬呈角弓反張勢(shì)；接種3×105.0TCID50的兩只犬均出現(xiàn)精神沉郁、厭食，于接種后7d出現(xiàn)輕微的體溫升高，但未死亡；接種1×105.0TCID50的兩只犬臨床癥狀不明顯，而未接種的犬均正常。對(duì)發(fā)病犬只的眼和鼻的膿性分泌物檢測(cè)為CEV陽性。將死亡的犬進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)肺尖出血、肝腫和淋巴結(jié)腫大、腹腔積液、腸系膜充血脫落。病理切片顯示肺泡結(jié)構(gòu)消失，有大量的炎性細(xì)胞，肺泡壁增厚，上皮細(xì)胞中出現(xiàn)包涵體；脾小體壞死，脾小梁平滑肌變性，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)包涵體。

3 討論

CDV雖然具有脂囊膜，但易被光和熱滅活，對(duì)環(huán)境的抵抗力也較弱，病毒的分離成功率很低，所以病料采集的部位、時(shí)間、樣品的處理方式、發(fā)病動(dòng)物的病程類型和抗體水平等因素都會(huì)影響病毒的分離。據(jù)報(bào)道分離培養(yǎng)CDV的傳代細(xì)胞系包括非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)、貓胚胎細(xì)胞系(FE)、犬腎細(xì)胞系(MDCK)、貓腎細(xì)胞系(CRFK)等細(xì)胞，但傳代細(xì)胞具有傳代不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，易發(fā)生毒力降低或細(xì)胞病變等現(xiàn)象。目前研究中培養(yǎng)CDV最常用的傳代細(xì)胞是Vero細(xì)胞，Vero細(xì)胞在接種后逐日可觀察到細(xì)胞變圓，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，胞漿空泡化，部分細(xì)胞壞死、脫落，呈拉網(wǎng)狀等現(xiàn)象。病毒純化一直是病毒研究中的難點(diǎn)，病毒純化方法歸結(jié)起來主要有物理和化學(xué)的方法，而不損害病毒粒子活性才是純化的關(guān)鍵。

CDV病毒的抵抗力不強(qiáng)，對(duì)熱和干燥敏感，50～60℃經(jīng)30min可滅活，炎熱季節(jié)CDV在犬群中不能長(zhǎng)期存活，但在-10℃可存活幾個(gè)月，在-70℃或凍干條件下能長(zhǎng)期存活，這是CD多流行于冬春季節(jié)的最主要原因。CDV屬于RNA病毒，對(duì)熱和干燥敏感，對(duì)環(huán)境的抵抗力弱，0℃以上感染力減弱，10℃感染力能迅速喪失，且極易被32℃以上的高溫和可見光滅活。CDV的分離比較困難，采樣的時(shí)間、部位、樣品處理、病程的類型等因素對(duì)病毒的分離都有一定的影響。為了防止臟器中RNA酶對(duì)CDV的降解，本試驗(yàn)在患病犬死后立即采取新鮮臟器，并馬上接種于vero細(xì)胞中進(jìn)行分離培養(yǎng)。雖有報(bào)道犬肺巨噬細(xì)胞(DLM)對(duì)CDV的初次分離非常有效，但DLM的分離和培養(yǎng)較難，容易受到污染，不利于試驗(yàn)的進(jìn)行，而Vero細(xì)胞對(duì)大多數(shù)動(dòng)物病毒具有廣嗜性，CDV能在該細(xì)胞上進(jìn)行復(fù)制，因此本試驗(yàn)采用Vero細(xì)胞對(duì)CDV進(jìn)行分離培養(yǎng)。

本試驗(yàn)中接種6×105TCID50的試驗(yàn)犬于接種后4-6d出現(xiàn)體溫升高，在第一次發(fā)熱后6～8d再次出現(xiàn)體溫升高，與田克恭、遇秀玲報(bào)道的一致。而本次試驗(yàn)通過犬出現(xiàn)食欲廢絕、鼻卡他、體溫呈雙相熱、腹瀉，眼、鼻出現(xiàn)膿性分泌物，剖檢見病犬肺尖出血、肝臟腫大、淋巴結(jié)腫大、腹腔有積液、腸系膜充血脫落、脾臟邊緣出血梗死等病變，病理切片還觀察到了肺臟、肝臟和脾臟的明顯病變均顯示了典型的臨床癥狀。

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