文蛤抗菌物質的粗提及活性檢測

張賽樂王雪鵬閆茂倉柴雪良艾為明謝起浪*

（①浙江省海洋水產養殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室 浙江 溫州 325005）

②山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 ③溫州生命科學學院 溫州醫學院海洋科學研究所）

文蛤抗菌物質的粗提及活性檢測

張賽樂①王雪鵬②閆茂倉①柴雪良①艾為明③謝起浪①*

（①浙江省海洋水產養殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室 浙江 溫州 325005）

②山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 ③溫州生命科學學院 溫州醫學院海洋科學研究所）

為了分離純化得到文蛤體內的抗菌活性蛋白，以滅活的副溶血弧菌誘導的方法，通過紫外分光光度計法測定其粗提品的蛋白質含量，并進行抗菌活性檢測，同時利用硫酸銨沉淀法對粗提物進一步純化、SDS-PAGE電泳檢測純度。結果顯示，文蛤經副溶血弧菌誘導后，產生的抗菌物質在短時間內達到高峰，隨后逐漸下降，大約在4h時對大腸桿菌抑制率最高；誘導4h時抑制率與對照相比無顯著差異(P＞0.05)。在經過硫酸銨沉淀后，SDS-PAGE電泳顯示條帶較多；進行Sephadex G-50凝膠過濾層析的最佳條件為洗脫流速0.2ml/min、樣品濃度3.0mg/ml。

文蛤 抗菌物質 硫酸銨沉淀 活性檢測 凝膠層析

海洋是生命的搖籃，其面積約占地球表面積的71%。目前已知的海洋生物有21萬種，由于海洋環境的特殊性(高鹽、高壓、低營養、低溫、無光照)，迫使海洋生物產生一些結構獨特并有顯著生物活性的代謝產物以適應嚴酷的環境，主要活性表現在抗菌、抗病毒、抗凝血、鎮痛、抗炎、抗腫瘤和抗心血管疾病等方面。我國海洋資源豐富，為海洋藥物的研究與開發提供了優越的基礎[1]。

在我國，文蛤(Meretrix meretrix)是一種天然資源豐富的灘涂貝類，為沿海主要的灘涂養殖貝類，是重要的海水增養殖優良品種，也是主要出口的鮮活水產品之一[2]。其經濟價值高、營養豐富、肉質鮮美。文蛤不僅肉質鮮美、營養豐富，而且具有很高的食療藥用價值。李時珍的《本草綱目》上說，它能治"瘡、癤腫毒，消積塊，解酒毒"等病。近代研究又表明：文蛤有清熱利濕、化痰、散結的功效，對肝癌有明顯的抑制作用，對哮喘、慢性氣管炎、甲狀腺腫大、淋巴結核等病也有明顯療效。目前，國內外學者也開展了文蛤中蛋白質和多糖等活性物質提取和分析的研究工作，也證實了文蛤中富含肽類等抗腫瘤活性成分。而近年來關于文蛤抗菌肽的研究未見報道。本文以滅活的副溶血弧菌為誘導物進行誘導，采用大腸桿菌(Escherichia coli)作為指示菌，對文蛤的組織提取物進行抗菌活性測定。可為灘涂貝類抗菌肽基因工程產品(抗菌藥物)的開發研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用文蛤(Meretrix meretrix)購于浙江省溫州市龍灣區某養殖場，于沙濾海水中暫養7d后進行誘導試驗。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，具有強致病性；大腸桿菌(Escherichia coli)為購買的大腸桿菌標準菌株ATCC25922。

1.2 副溶血弧菌誘導物的制備 副溶血弧菌菌株接種于Zobell 2216E斜面，28℃培養24h，用0.65%生理鹽水洗下菌苔，加入終濃度為0.3%的甲醛滅活24h后，用TCBS培養基檢測滅活效果。確認徹底滅活后，用0.65%生理鹽水洗3次，配成終濃度為1×107cfu/ml滅活副溶血弧菌的海水用于誘導。

1.3 誘導 將文蛤浸泡在1×107cfu/ml滅活副溶血弧菌的海水中，定期采集組織。

1.4 取樣 于誘導0、4、8、12和24h后(分別為對照組、P1、P2、P3和P4組)取0.50kg的文蛤去殼，將組織剪碎勻漿，勻漿液4℃保存。

1.5 抗菌物質的提取 勻漿液中按體積比1:1加入5%乙酸，4℃攪拌過夜，次日將混合物于4℃、5000r/min離心30min，取上清，4℃保存。將沉淀物用等體積5%乙酸混合，再次4℃攪拌浸提過夜。重復上述離心過程，取上清，合并2次上清液，調節pH為7.0，再離心，棄沉淀，收集上清液，即為粗提品，-20℃保存，部分產物冷凍干燥保存。

1.6 蛋白質含量的測定 采用紫外分光光度法測定蛋白質含量：總蛋白質含量(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260×稀釋倍數。

1.7 硫酸銨沉淀 將凍存的誘導4h制備的粗提物樣品取出，4℃下融化，滴加等體積飽和硫酸銨溶液使其飽和度達50%，4℃靜置過夜后離心得到沉淀物，用原1/2體積PBS緩沖液溶解，并透析除鹽。

1.8 抗菌試驗 采用微量比濁法[3-5]，菌懸液的制備取細菌菌種接于Zobell 2216E液體培養基，28℃培養16h后，以Zobell 2216E液基調整菌濃度到104cfu/ml，備用。取96孔板，每孔加入10μl抗菌提取物、硫酸銨沉淀產物，然后每孔中加入90μl菌懸液，28℃培養12h。同時設置作生長對照和重復。用酶標儀于450nm處，測定吸光度值。

1.9 Tris-Glycine SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[6]（1）制膠：參照寶生物工程(大連)有限公司提供的配方，配制濃縮膠、分離膠的濃度分別為5%和12%，緩沖體系為Tris-Glycine體系。（2）制樣：將樣品溶于樣品緩沖液，100℃沸水浴5～10min，5000r/min離心5min，取上清用微量加樣器上樣。（3）電泳：80V恒壓電泳，當溴酚藍指示帶達到分離膠時，加大電壓至140V。（4）染色：取出凝膠，放入考馬斯亮藍R-250染色液中，染色1～2h。（5）脫色：傾去染色液，以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動直至獲得藍色條帶及干凈的背景。

1.10 Sephadex G-50凝膠過濾層析 試驗采用Sephadex G-50凝膠柱，用PBS緩沖液進行平衡。取500μl鹽析產物上樣，在280nm紫外下監測洗脫情況。

2 結果

2.1 總蛋白質含量 乙酸抽提所得的粗提品顏色均為淡黃色、透明溶液，其總蛋白質含量在誘導呈先升高后降低的趨勢。

表1 不同誘導時間粗提品的理化性質及蛋白質含量 (mg/ml)

2.2 抗菌活性試驗 采用微量比濁法，以大腸桿菌作指示菌，根據吸光度值計算生長抑制率IR(%)，IR(%)=(1-A/A0)×100%，其中A為實驗組的吸光度值，A0為生長對照組的吸光度值。

表2 不同誘導時間粗提品的抗菌活性

由表2看出，文蛤經副溶血弧菌誘導后，產生的抗菌物質在短時間內達到高峰，隨后逐漸下降，大約在4 h時抑制率最高。

表3 不同誘導時間鹽析組分的抗菌活性

由表3得知，文蛤粗提品經硫酸銨沉淀后所得產物均具有抗菌活性，且其抑制率有不同程度的提高，說明鹽析產物中抗菌物質含量相較粗提品有所升高，為進一步純化奠定基礎。

圖1 不同誘導時間粗提品的SDS-PAGE電泳圖譜

圖2 不同誘導時間鹽析組分的SDS-PAGE電泳圖譜

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果 通過SDS-PAGE電泳圖譜1、2比較可知，粗提品蛋白條帶比較多，經過硫酸銨沉淀后得到的產物條帶相對比較清晰，但仍有雜蛋白存在，還需要通過其他方法來進一步提純，如離子交換、凝膠層析、親和層析等。

2.4 Sephadex G-50凝膠過濾層析 凝膠過濾層析效果受多種因素影響[7]，采用經4h誘導后制備的鹽析組分為上樣液比較洗脫流速與樣品濃度對Sephadex G-50分離文蛤抗菌蛋白效果的影響。（1）不同洗脫流速對Sephadex G-50分離文蛤抗菌蛋白效果的影響。其它層析條件不變的情況下，本試驗選擇了4個不同洗脫流速，0.1ml/min、0.2ml/min、1.0ml/min的分離曲線。當流速為1.0ml/min時，由于流速過快，出峰相對較快，一些小峰不能分開；流速為0.1ml/min時，雖能到達最好的分離效果，但由于低流速導致工作效率降低。因此選擇0.2ml/min作為最佳洗脫流速。（2）不同樣品濃度對Sephadex G-50分離文蛤抗菌蛋白效果的影響。在其他層析條件固定的情況下，選擇了1.0mg/ml與3.0mg/ml 2個不同的樣品濃度進行分離。樣品濃度過低，如1.0mg/ml，使洗脫出來的分離組分吸光度降低，即濃度降低，影響分離的效率，并給以后的樣品出來帶來不便。因此選擇3.0mg/ml作為最佳樣品濃度。

3 討論

在貝類的免疫系統中，除了以通過吞噬作用完成的細胞免疫外，血淋巴中的溶酶體酶、凝集素、非特異性抗菌肽等體液因子也發揮了重要的防御作用[8,9]。近年來，雙殼貝類的抗菌物質成為研究的一個熱點。郭道森等[10]從毛蚶(Scapharca subcrenata)血漿中分離的抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、四連微球菌具有較強的抑菌活性，且該抗菌蛋白具有很好的熱穩定性，對胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感；Maurice等[11]從貽貝(Mytilus Edulis)血液中分離出一類富含半胱氨酸的防御素Mytilin A，具有抗革蘭氏陰性和陽性菌活性，且能殺滅部分真菌；洪旭光[4]從櫛孔扇貝(Chlamys farreri)血液純化出一種全新的抗菌肽(其分子量為2000Da)，不僅有抗真菌活性，還有潛在的抑制腫瘤的作用；Jung-Kil Seo[12]從美國耗(Crassostrea virginica)鰓組織中純化得到cvH2B.，其氨基酸序列被認定為與組蛋白H2B相似，夠抑制包括副溶血弧菌和創傷弧菌在內的革蘭氏陰性菌。雙殼貝類抗菌物質的研究對利用其以治療外界微生物入侵引起的疾病有重大的作用。

文蛤生活在灘涂中，且飼養環境也不是無菌，故在養殖期間內不可避免有一定的細菌生長，這可能導致對照與誘導4h時的抗菌物質對大腸桿菌生長的抑制作用無顯著差異。至于該抗菌物質是否為飼養環境中的細菌進入文蛤體內后刺激機體免疫系統所產生，還需要進一步研究。粗提品對大腸桿菌有一定的抑制作用，副溶血弧菌誘導后大約在4h達到高峰，隨后抑制率逐漸降低；經硫酸銨沉淀后，通過兩次SDS-PAGE電泳對比發現，純度有所提高，也可由兩次的抗菌活性試驗推斷得知。但鹽析產物SDS-PAGE電泳顯示仍有較多蛋白條帶，還需進一步純化。

本研究選用了Sephadex G-50Fine，其分子量分級范圍為：球蛋白1500～30000，初步探討了洗脫流速和樣品濃度對Sephadex G-50分離文蛤抗菌物質效果的影響，洗脫流速過快無法分開一些小峰樣品，但流速過慢導致工作效率降低；濃度過低易影響分離的效率，且對后續的樣品處理造成不便。另外，凝膠層析分離效果還與葡聚糖凝膠類型、樣品的粘度[7]等有關。本研究工作的開展為后續進行文蛤的活性跟蹤，確定其抗菌活性成分，發現新的抗菌物質提供了一定的線索。

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S885.3+9

A

1007-1733(2014)07-0003-03

2014–04–09）

溫州市科技計劃項目(S20100016), 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室開放基金項目(J201205), 浙江省科技計劃項目(2012F20029), 中央財政支持地方高校發展專項學科項目(xkc11011), 國家863項目(2012AA10A410-1). 國家貝類產業技術體系浙江綜合試驗站(CARS-48), 浙江省重大科技專項(2012C12017-3),溫州市科技計劃項目(2011N0006)

*通訊作者