馬立克疫苗的質量檢測及其對雞源食品安全的影響分析

薛墨庸 程合剛 （山東農業大學 山東 泰安 271018）

馬立克病(marek′s disease，mD)是由皰疹病毒科、細胞結合性馬立克病病毒(marek′sdisease virus，mDV)引起的一種高度接觸傳染性、淋巴組織增生性腫瘤疾病。該病是第一個能用疫苗預防的腫瘤性疾病，因此受到了醫學界、獸醫學界、病毒學界的廣泛關注。目前，還沒有有效的方法來治療mD患雞，仍通過疫苗預防控制該病的發生。mD疫苗CVI988/Rispens株仍然是控制mD感染的主要疫苗之一，可有效控制預防超強毒力mDV(vvmDV)和超超強毒力mDV(vv+mDV)[1]。該疫苗對生產、運輸和貯存的要求條件較高，任何一個環節出現問題對疫苗的質量都會造成一定的影響。其中疫苗毒力的大小和有無外源病毒的污染是衡量疫苗質量的兩個重要指標，疫苗毒力過有可能對雞群形成有效保護力不夠，有外源病毒如禽白血病病毒(ALV)的污染則會引入場外病毒，任何一個方面的不達標則極易造成不同程度的經濟損失。本研究檢測的外源病毒之一的ALV，屬于反轉錄病毒科、а反轉錄病毒屬，引起禽類造血組織中某些細胞成分過度增生的腫瘤性疾病。ALV的感染還可引起雞群的免疫抑制和生產力的嚴重下降[2,3]。根據致病性和感染宿主的不同，ALV被劃分為A-J 10個亞群，外源性病毒J亞型ALV(ALV-J)是目前我國地方品種雞群中主要的流行亞型，A、B亞型也很常見。內源性E亞群(ALV-E)為整合在雞染色體中一種前病毒DNA，在雞群中普遍存在，致瘤性很低，不能產生感染性病毒粒子[4]，但內外源性ALV的重組將導致高致病性毒株的產生[5]。

食品安全是指對食品按其預期用途進行制作、食用時不會使消費者健康受到損害的一種保證。食品安全可追溯到食品加工業的上游，可謂抓安全性必然從源頭抓起，源頭有很多種，其中畜牧養殖業就是食品源頭的重要一環，例如加強動物疫病的防疫，杜絕有害的飼料添加劑等，由此疫苗行業也值得更多的關注。

本研究對山東某種雞場送檢的某國外疫苗公司生產的CVI988/Rispens株mD疫苗進行毒力測定和ALV是否污染的檢測，通過評估該類疫苗的質量水平，探究該種雞場發生疑似mD的可能因素，以此為例探討了mD疫苗質量對雞群及至對雞源食品安全生產的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 山東某種雞場送檢的不同時間生產的兩個批次的CVI988/Rispens株mD疫苗編號為F11、F21、F22，批號依次為C006311、C006111、C006311，規格均為2000羽，運輸過程中保存于液氮。

1.2 主要儀器和試劑 蛋白酶K購自華美生物工程公司；PCR Kit、DNA marker DL2000、rTaqE(5U/μl)、dNTPs、pmD18-T均購自TaKaRa公司；感受態細胞Trans-T1購自北京全式金公司；膠回收試劑盒購自美國OmEGA公司；DmEm培養基和新生牛血清購自GIBCO公司；胰酶購自德國mERCK公；SPF雞胚來自濟南賽斯家禽科技有限公司；ELISA檢測ALV p27抗原試劑盒來自IDEXX，編號為09254-AJ944(抗原)。其他常規試劑均為國產分析純。

1.3 mD疫苗的毒力測定 所有疫苗融化后取100ul疫苗液，按照有限稀釋法進行測定。每天觀察并記錄蝕斑的數量，直到蝕斑數量穩定不變，共觀察7d。用Reedmuench方法計算疫苗的毒力。

1.4 mD疫苗中ALV p27抗原的ELISA檢測 將剩余疫苗置于-80℃冰箱和室溫反復凍融3次，以裂解mDV。從裂解后的mD疫苗原液中取150ul，2000rpm，2min離心后取上清用ELISA試劑盒檢測上清中的p27抗原，所有樣品各設3個重復(大于S/P臨界值0.2的樣品為陽性)。

1.5 mD疫苗細胞培養后ALV p27抗原的ELISA檢測 將處理的疫苗上清接種CEF，2h后，將細胞生長液換為細胞生長維持液，培養9d后檢測細胞上清中的ALV p27抗原。同時設置未接種樣品的CEF為對照。所有樣品各設三個重復。

1.6 mD疫苗細胞培養后ALV的PCR檢測 將接毒培養9d后的CEF收集到1.5ml的離心管中，2000rpm，2min離心，棄上清，沉淀用組織抽提液重懸，加入10ul蛋白酶K，55℃消化8h，用苯酚氯仿法提取細胞DNA,用針對ALV-J的gp85基因(924 bp)[6]引物(簡寫為ALV-J-gp85)和針對A-J囊膜蛋白基因(env)(2400bp，含LTR序列)引物(簡寫為ALV-ALL)做PCR檢測(見表1)。反應體系為25ul。ALV-Jgp85反應程序：94℃預變性8min，94℃變性45sec、60℃退火45sec、72℃延伸1min(30個循環)，72℃總延伸10 min，4℃保存。env基因反應程序為：95℃預變性5min、95℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min30sec(30個循環)，72℃總延伸10min，4℃保存。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將陽性產物回收、連接、轉化的克隆產物驗證成功后送上海鉑尚生物工程公司測序。用DNAstar軟件對基因進行分析。

表1 ALV鑒別診斷引物

2 結果

2.1 mD疫苗的毒力測定結果 疫苗F11、F21、F22的毒力分別為800PFU/羽份、1300 PFU/羽份、1480PFU/羽份，均低于國家獸醫藥典規定的2000PFU/羽份，F11低于OIE規定的不低于1000 PFU/羽份的要求。

2.2 mD疫苗原液ALV p27抗原檢測結果 mD疫苗F11、F21、F22凍融后上清中p27抗原均為陽性，S/P值分別為0.417、0.43、0.256。

2.3 mD疫苗細胞培養上清中ALV p27抗原的ELISA檢測結果 F11、F21、F22細胞上清ALV p27抗原均為陽性，S/P值分別為0.657、0.733、0.774。未接種樣品的對照用CEF檢測結果為陰性。

2.4 mD疫苗細胞培養后ALV的PCR擴增與測序結果 將得到的F11、F21、F22囊膜蛋白(env)基因序列(PCR方法擴增2400bp片段，包括LTR序列)與參考株mAV-1(A)、RAV-1(A)、RSV-SchmidtRuppin(B)、RSVPr-C(C)、D10652R SV-D(D)、RAV-0(E)、SD0501(E)、HPRS-103(J)、ADOL-7501(J)序列進行同源性分析，結果顯示，3瓶疫苗中擴增的ALV序列與參考毒株SD0501(E)、E-strain-1同源性均為98%以上(表2)，遺傳進化樹分析結果表明，疫苗中污染的ALV與ALV-E參考株SD0501的親緣關系最接近，說明分離到的毒株屬于ALV-E(附圖)。J亞型檢測結果為陰性。

表2 mD疫苗中污染的ALV株與國內外參考株的核苷酸序列同源性比較(%)

附圖 mD疫苗樣品中污染的ALV株與不同參考株的遺傳進化樹關系

3 討論

（1）養殖生產中經常發生一些不明原因的免疫失敗現象，給企業造成重大的經濟損失。除了免疫程序、母源抗體干擾、病毒持續感染等因素外，疫苗質量下降、活疫苗遭受外源病毒污染的現象也屢見不鮮。由各種原因導致的mD疫苗保護效力不足，會導致雞群免疫失敗，不能控制和防止雞群中mD的出現。Silva等利用PCR方法對商品mD疫苗進行檢測時，發現了ALV的污染[7]。受污染疫苗的使用會加重該疫病的傳播，放大并嚴重危害養禽業的健康發展。種雞場出現mD的雞只不一定是疫苗質量的問題，與疫苗本身的免疫保護指數，注射部位，免疫程序等有一定關系。（2）本研究結果顯示，送檢的3瓶mD疫苗的免疫劑量均低于國家獸醫藥典規定的2000PFU/羽份，但有2個批次(F21，F22)滿足OIE規定的不少于1000PFU/羽份的要求，疫苗質量和生產狀況等還需進一步的提高。檢疫部門也應加大ALV的檢測力度，提高檢出率，確保在生產疫苗過程的細胞培養等階段無ALV的感染，在生產中完成有無ALV污染的檢測。送檢疫苗的種雞場發生mD，無論何種原因所致，但顯然，不合格mD疫苗的應用是雞群發生mD腫瘤病的原因之一。而發生腫瘤的雞群往往存在抗生素藥量超標及濫用問題，影響禽蛋肉等雞源食品質量，危害人民群眾的生活健康。（3）近年來食品安全事件頻發，如2012發生的過量藥物喂養的抗生素雞，以及一直不斷發生的、禽流感和豬藍耳病等，動物疫病一直在威脅著食品安全。隨著人民生活水平的提高，對農產品質量要求更高，不僅要吃好，而且要吃出健康。食品安全的問題一直是國家和公民所關注的頭等大事。隨著強制免疫品種的擴大，規模化養殖程度的提高，疫苗市場的規模還有很大的提升空間；隨著民眾對食品安全事件的關注度提高，國家將繼續加大對全國制售假獸藥、違法添加違禁藥物的力度。而這些都 與生產源頭的雞苗質量與疫苗質量密切相關。

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[3]Gavora J S, Spencer J L, Gowe R S, et al.Harris.Lymphois leukosis virus infection:effects on production and mortality and consequences in selection for high egg production[J].Poult Sci, 1980, 59:2165-2178.

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