南充市鉤體患者血清IFN-γ、TNF-α、IL-10動態觀察

張廷君，周仲輝，曾 躍，劉鳳君，王貴霞，林家福

(川北醫學院附屬醫院感染科，四川 南充 637000)

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)所致的急性動物源性傳染病，該病在全世界范圍內流行，我國大部分省、市、自治區均有本病的報道[1]。然而，鉤體病的發病機制至今仍未被闡明，隨著對該病的深入研究，細胞因子在鉤體致病過程中的作用越來越受到各地研究者們的重視，體外研究[2-3]發現鉤端螺旋體可以促進人體外周血細胞分泌一些細胞因子，其中IFN-γ、TNF-α、IL-10三種因子均有大量表達。而另有學者從鉤體病患者血清中也檢測到這幾種細胞因子的升高[4]，但目前為止，動態連續觀察研究鉤體病患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10細胞因子的報道甚少。本研究的目的在于了解鉤體病人血清中細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10在該病的敗血癥期、器官損傷期及恢復期的變化規律，證實細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10在鉤體清除及致病過程中的作用，為臨床及科研提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本 31例臨床診斷鉤體病患者標本均于2011年取自南充市儀隴縣各醫院及川北醫學院附屬醫院，根據采取患者血清標本時患者所處的臨床分期即鉤體敗血癥期、器官損傷器、恢復期，將相應標本分為早期、中期、晚期三組：起病后3 d內為早期，起病后3～10 d或生化檢查表明處于器官損傷期的為中期，好轉出院(并且病程大于10 d)時采集的最后一次血為晚期標本[1]。對照標本共10例，男性5例，女性5例，平均年齡(48.20±10.39)歲，均為鉤體病流行地區健康體檢者靜脈血血清。

1.1.2 主要試劑 無菌兔血清及鉤體標準株購自四川省疾控中心，EMJH培養基購自BD公司，鉤體基因組DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，2*Taq PCR MasterMix購自TIANGEN BIOTECH公司，人IFN-γ、TNF-α、IL-10酶聯免疫試劑盒購自成都微克生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1確立診斷 對31例臨床診斷的患者的血清分別用血清顯微凝集試驗(MAT)(委托四川省疾控中心檢測)、聚合酶鏈反應(PCR)、鉤體分離培養三種方法進行檢測，據鉤端螺旋體病診療指南，三種檢測方法任一陽性均可以確定為實驗室診斷患者。

1.2.2檢測細胞因子 采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法(ABC-ELISA)檢測血清IFN-γ、TNF-α、IL-10濃度(分別采用人IFN-γ、TNF-α、IL-10酶聯免疫試劑盒)。

1.3 統計學分析

對所有實驗數據首先進行正態性檢驗，然后用SPSS v16.0統計軟件處理，各期病例組與正常人的比較用一維方差分析Dunnett檢驗，各病例組之間兩兩比較用雙因素重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗室診斷病例結果

鉤體分離培養、MAT、PCR檢測確定為實驗室診斷病例24例，其中MAT法確診2例，PCR法確診24例，分離培養確診0例，其中MAT法和PCR法均陽性2例；男性12例，女性12例。

2.2 患者各期血清及正常對照血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的均值(表1)

表1 早、中、晚期血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平均數

*P<0.05，與早期組比較；#P<0.05，與中期組比較；△P<0.05，與晚期組比較。

因部分患者入院時已經處于病程中期，故早期標本數較中期少；部分患者未好轉則自動離院，故晚期標本數較中期少。

2.3 各期血清IFN-γ水平比較

早期、中期患者血清中IFN-γ一直處于較高的水平，到晚期略有下降，但三組血清IFN-γ均明顯高于對照組(P<0.05)；兩兩比較早、中、晚期三組血清IFN-γ水平無差別(P>0.05)。

2.4 各期血清TNF-α水平比較

各期患者血清與對照組比較：早、中期TNF-α水平明顯高于正常人(P<0.05)，晚期血清TNF-α水平與正常人無差別(P>0.05)。病人早期血清中可檢測到較高水平的TNF-α，到中期達最高，晚期明顯降低。三期兩兩比較結果顯示：中期TNF-α水平明顯高于早期和晚期(P<0.05)，早期與晚期無明顯差異(P>0.05)。

2.5 各期血清中IL-10水平比較

各期患者血清與對照組比較顯示：病例組血清中的IL-10均較正常人高，(P<0.01)。患者三期血清中IL-10水平由早期到晚期逐漸下降，兩兩比較結果顯示差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

本研究中所取臨床診斷的31例標本中，實驗室確診24例，其中MAT法確診2例，PCR法確診24例，分離培養確診0例，其中MAT法和PCR法均陽性2例。PCR法檢測陽性率最高，血液分離培養陽性率最低，其可能的原因為：其一，接種時只取兩滴血液，血液中的活菌太少；其二，血液中的血漿，膠質，蛋白質等成分影響了觀察效果。從檢測陽性率的角度看，本實驗中PCR法陽性率最高，其快速、易操作、經濟等優點均有利于該方法的推廣。盡管分離培養法陽性率低，但是該方法能培養出病原菌，豐富病原庫的作用是其他任何一種檢測方法都無法取代的。本研究采用了三種方法檢測臨床診斷的病例進行病原學診斷，一定程度上提高了診斷的陽性率。

細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10所介導的免疫反應及其在免疫反應中引起的瀑布效應在機體清除病原體和造成機體損傷過程中起著至關重要的作用，本實驗通過檢測24例實驗室確診患者早、中、晚三期血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的水平，結果發現三種因子呈現出各自的變化規律。

IFN-γ也叫免疫干擾素，具有較強的調節免疫和抗細胞增殖作用[5]，在細胞免疫清除病原體的過程中起著重要的作用。Vernel-Pauillac等關于鉤體的體外研究表明[2,4]致病性鉤體可以激活外周血中T淋巴細胞，并產生相關Th1型細胞因子IFN-γ。時曼華等通過動物實驗研究推測鉤體的清除可能和其他細胞內感染細菌的清除一樣與細胞免疫有關[6]。本研究發現在鉤體病患者早期、中期晚期血清中的IFN-γ水平均明顯高于對照組。表明在整個病程中細胞免疫處于持續活躍狀態。四川省研究者對大量鉤體病患者進行長時間觀察發現恢復期的病人仍然可以長時間的排出鉤體[7]，提示雖然患者的癥狀緩解，病情恢復，但體內的鉤體并沒有完全清除，這可能也是到了疾病的晚期，血清中的IFN-γ水平依然處于高水平的原因。IFN-γ在鉤體病患者血清中明顯升高且隨著病程的進展所表現的規律，提示IFN-γ在鉤體的清除及病情的進展中有重要的意義，其具體的作用機制還需要進一步探索。

TNF-α是免疫反應中重要的促炎性細胞因子，具有多種生物學活性，它在全身炎癥反應及早期器官損傷中發揮著關鍵至關重要的作用[8]。既往研究[3]發現鉤體的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和糖脂蛋白(glycolipoprotein,GLP)能刺激淋巴細胞產生過量的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)。Chierakul通過動物實驗[9]發現倉鼠被鉤體感染后最早升高的促炎細胞因子是TNF-α，Tajiki等[10]報道16例鉤體病患者中4例出現器官損害者血清TNF-α水平明顯升高。本組實驗監測的鉤體病患者早期血清中的TNF-α水平較對照組明顯升高，中期的TNF-α水平較早期的高，到恢復期則與正常人的水平無明顯差異，與上述研究結果一致。可能是因為當鉤體進入人體并刺激人體產生高水平的TNF-α，人體通過TNF-α調節免疫反應清除病原體；同時，TNF-α引起的炎癥反應也導致了人體組織、器官的損傷，從而引發各種臨床表現。在恢復期，TNF-α恢復到正常水平，炎癥反應停止，各器官功能也恢復正常。提示TNF-α在鉤體致病的過程中起著重要的作用，而且，在鉤端螺旋體病發生發展過程中，TNF-α水平的高低可能與疾病的嚴重程度相關。

IL-10是一種有效的抗炎性物質[11]，具有較強的抗炎癥能力，抑制細胞免疫，介導體液免疫并消滅病原體[12]。Diament等[13]通過體外實驗發現鉤體的糖脂蛋白能引起IL-10水平升高。Marinho等[14]研究發現感染鉤體的倉鼠體內的IL-10水平較對照組明顯升高。本實驗通過檢測不同時期臨床標本發現鉤體病患者早期血清中IL-10處于較較高的水平，隨著病情的進展，中晚期血清中的IL-10水平有逐漸下降的趨勢，但晚期IL-10水平仍然明顯高于正常人。可能是因為在鉤體病的病程早期，機體內的鉤體數量最多，由于機體的免疫反應及使用抗生素消滅鉤體，到晚期大部分患者體內鉤體被清除，但體內仍可能殘留有鉤體。四川省研究者對97例鉤體病人進行臨床觀察發現在病程的晚期，仍然有14.43%鉤體病患者能夠長時間的排出鉤體[8]，這提示IL-10及其介導的體液免疫在鉤體的清除中起著重要作用，可能在恢復期體液免疫占主要地位。

總之，本研究通過三種不同的檢測方法檢測臨床診斷的鉤體病患者，以取得實驗室確診依據，證實了PCR法陽性率最高，值得臨床推廣；通過動態研究鉤體病患者血清中代表細胞免疫的Th1型細胞因子IFN-γ、促炎性細胞因子TNF-α及代表體液免疫的Th2細胞因子IL-10在病程中的變化規律，從臨床的角度證實了IFN-γ、IL-10和TNF-α可能在機體清除鉤體及疾病的發展過程中均起著重要的作用，其具體的作用機制尚需進一步研究。

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