重組人p53腺病毒在乳腺癌裸鼠體內耐藥逆轉作用及其對P-糖蛋白表達的影響

紀 楠，董 懿，唐 欣，劉愛惠，王鋼樂

重組人p53腺病毒在乳腺癌裸鼠體內耐藥逆轉作用及其對P-糖蛋白表達的影響

紀 楠，董 懿，唐 欣，劉愛惠，王鋼樂

目的研究重組人p53腺病毒(rAd-p53)對人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠移植瘤的耐藥逆轉作用及其對耐藥相關P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)表達的影響。方法建立人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐藥模型，隨機分為對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯合組，分別給予不同治療。觀察裸鼠腫瘤體積的變化， western blot檢測P-gp蛋白表達情況。結果成瘤后rAd-p53組、阿霉素組、聯合組抑瘤率分別為42.05%、49.21%、69.97%，各治療組體積與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，且聯合組顯著優于rAd-p53組和阿霉素組(P<0.05)。對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯合組P-gp表達水平分別為(0.5964±0.0806)、(0.5506±0.0127)、(0.5641±0.0055)、(0.4652±0.0982)，聯合組P-gp表達水平低于其他各組。結論Ad-p53對人乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF-7/ADR建立的裸鼠移植瘤具有多藥耐藥的逆轉作用,并可下調P-gp的表達。

乳腺癌；p53基因；多藥耐藥；P-糖蛋白

腫瘤細胞的多藥耐藥(multi-drug resistance, MDR)是指腫瘤細胞對多種結構類型和作用機制不同的藥物同時產生抗藥性，從而降低化療藥物的療效。多藥耐藥性可成為影響化療療效的主要屏障。腫瘤產生MDR的原因十分復雜，其中多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1, MDR1)編碼的跨膜蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)高表達為其主要機制之一[1]。p53基因突變或缺失是目前發現的人類腫瘤細胞中最常見的基因突變之一，人類腫瘤中約50%存在p53基因突變[2]，其突變或缺失在多種腫瘤的發生發展及腫瘤化療耐藥的形成中起著重要作用，導致化療失敗[3,4]。有研究表明，突變型p53基因可增強MDR1/P-gp的啟動子表達[5]，因此認為在腫瘤發生發展過程中MDR1/P-gp表達可能是p53抑癌基因突變失活的結果。本研究中，筆者以腺病毒介導的野生型p53基因導入到含突變型p53基因的人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐藥模型中，觀察對其耐藥性、P-gp表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細胞株及其阿霉素耐藥株MCF-7/Adr購自中國醫學科學院腫瘤研究所；BALB/c裸鼠，雌性，4～6周齡，17～20 g，購自首都醫科大學實驗動物部，SPF環境飼養；重組人p53腺病毒注射液(rAd-p53)購自深圳賽百諾公司；阿霉素購自意大利法瑪西亞普強公司； RPMI-1640、小牛血清均購自Gibco公司；β-actin由上海生工合成；鼠抗P-gp(C219)單克隆抗體購自Alexis公司；熒光標記山羊抗小鼠IgG購自rockland公司；β-Actin(C4)為Santa Cruz公司產品。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒滴度測定 rAd-p53劑量為1×1012VP/支(VP:病毒顆粒,virus particle),空斑實驗確定其滴度為1×1010PFU /支(PFU:空斑形成單位,plaque forming unit)。

1.2.2 細胞培養 將人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR置于10%胎牛血清的RMPI 1640培養液，在37 ℃，5%CO2飽和濕度培養箱中進行培養，細胞為單層貼壁生長。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3～4 d傳代1次。

1.2.3 人乳腺癌耐藥裸鼠模型的建立及分組給藥 取對數生長期MCF-7/ADR細胞進行實驗。收集細胞并用PBS液配置成為5×107/ml細胞懸液。于5只BALB/C雌性裸鼠的右側第2乳墊部位注射，0.1 ml/只，接種20 d后接種部位出現結節，待接種腫瘤直徑長至5 mm，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝除腫瘤塊，用其作為瘤源，將瘤塊切成直徑約2 mm，應用套管針埋入20只實驗裸鼠右側第2乳墊部位。乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR裸鼠移植瘤耐藥模型建立。自腫瘤成功插塊于裸鼠后第2天起，每日觀察并隔2 d測量腫瘤體積，待第14天插塊腫瘤直徑長至5 mm后，隨機將20只裸鼠分為4組，每組5只，分別為對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯合給藥組。自分組之日起，治療方法為：(1)對照組，瘤內注射生理鹽水0.1 ml/只，隔日給藥，共7次；(2)rAd-p53組，第3天起，瘤內注射rAd-p53，每次5×1010Vp/只，隔日1次，共6次；(3) 阿霉素組，阿霉素4 mg/(kg·次)尾靜脈注射，每4 d 1次，共4次；(4) 聯合組，兩藥給藥方法同前。

1.2.4 腫瘤體積測量及形態學觀察 自分組之日起，用游標卡尺隔2 d測量腫瘤長短經，根據公式V=ab2/2(a為長徑，b為短徑)計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線、計算抑瘤率。同時自給藥之日起觀察裸鼠精神、飲食、活動、糞便等。用藥后第44天，頸部脫臼法處死全部負瘤裸鼠，解剖裸鼠，觀察局部浸潤情況及有無其他臟器轉移。

1.2.5 P-gp表達的檢測 采用western blot半定量法。取腫瘤組織，用剪刀剪成細小顆粒，將樣品加入含1 mmol/L DMSF的RIPA裂解液，并在冰域條件下于預冷的研缽中研磨均一，冰域條件下超聲1 min，13 000 r/min,4 ℃離心15 min,取上清提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。以30 μg/孔 上樣，在8% SDS分離膠中恒壓120 V進行電泳90 min，后100 V濕轉至PVDF膜70 min，常溫搖床下封閉1 h，鼠抗P-gp單克隆抗體(1∶1000)4 ℃孵育過夜，常溫搖床TBST洗膜3次，熒光標記山羊抗小鼠IgG(1∶3000)常溫搖床孵育1 h，常溫搖床TBST洗膜3次，以β-actin(1∶1000)作為內參照，Odyssey熒光掃描。

2 結 果

2.1 裸鼠腫瘤體積變化及形態學情況 實驗裸鼠被種植14 d后成瘤率為100%。用藥后觀察至第44天，腫瘤生長曲線見圖1。對照組，rAd-p53組，阿霉素組，聯合組腫瘤終末體積分別為(472.5±69.6)mm3，(273.8±50.4)mm3，(240±73.8)mm3，(141.9±44.8)mm3，各治療組抑瘤率分別為42.05%，49.21%，69.97%，與對照組相比，體積差異均具有統計學意義(P<0.05)，且聯合組顯著優于rAd-p53組和阿霉素組(P<0.05)。解剖全部裸鼠，肉眼可見：腫瘤呈結節狀生長，包膜完整，未向周圍浸潤，腫瘤切面灰白色，有部分出血壞死灶。雙肺無腫瘤結節轉移灶。

2.2 P-gp蛋白表達 Western blot檢測顯示見圖2，對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯合組的P-gp相對表達水平分別為0.5964±0.0806、0.5506±0.0127、0.5641±0.0055、0.4652±0.0982。與對照組相比，聯合組對P-gp蛋白表達的影響差別有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

目前，在乳腺癌綜合治療中，化療仍是重要手段。然而，許多乳腺癌患者經歷了最初的一段有效化療之后，出現腫瘤復發、轉移，這主要歸因于腫瘤MDR的產生，后者又與多種機制有關,其中MDR1/P-gp的高表達最為重要。文獻[6]報道指出，未治乳腺癌中P-gp表達率約為40%，說明部分乳腺癌患者在接受化療前就已存在MDR，而經化療后P-gp蛋白的表達率可提高37%。此時化療可誘發P-gp表達率增高[7-14]。

野生型p53基因所編碼的p53蛋白在參與細胞周期調控、誘導細胞凋亡、調節化療敏感性等方面發揮著關鍵性的作用。近年來有研究表明，p53基因突變導致了其正常功能的喪失，參與了腫瘤化療耐藥的形成，導致化療失敗[7,8，15，16]。乳腺癌患者中20%～35%存在p53基因突變[9]，在不同的分子亞型中有著明顯的差異，其中基底樣乳腺癌患者中p53基因突變明顯高于其他亞型[13]，這嚴重制約了乳腺癌治療中化療藥物效能的發揮及患者的預后[14]。基于對p53基因的認識，筆者通過構建表達突變型p53的人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐藥模型，以其為研究對象，應用重組腺病毒介導的野生型p53基因對其進行轉染，并聯合阿霉素進行治療，發現腫瘤生長明顯受到抑制，且聯合組較Ad-p53及阿霉素單獨用藥組對腫瘤的生長抑制作用更為顯著。

P-gp是由多藥耐藥基因1(MDR1)基因編碼的一種170 ku的跨膜蛋白，它是一種ATP依賴性轉運排出泵，通過ATP提供能量將已進入細胞內的藥物從胞內泵出胞外，使腫瘤細胞內藥物濃度降低，從而減弱藥物的細胞毒作用，產生耐藥性[11]。有研究表明，突變型p53與Ets-1協同作用于MDR1啟動子的Ets結合位點，從而促進內源性MDR1的轉錄及P-gp的表達[12,13]。本研究在向MCF-7/ADR移植瘤轉染了Ad-p53后，對移植瘤組織中的MDR1基因所表達的P-gp蛋白進行檢測，發現導入野生型p53基因后P-gp表達有所下降，而野生型p53聯合阿霉素可使P-gp表達下降更為而顯著，可見Ad-p53通過影響MCF-7/ADR裸鼠移植瘤中的P-gp蛋白表達可以在裸鼠體內逆轉MCF-7/ADR移植瘤的MDR。

總之,p53基因和P-gp與腫瘤耐藥性有密切聯系,本研究結果表明Ad-p53可以通過下調P-gp的表達,逆轉MCF-7/ADR裸鼠移植瘤的耐藥性,為臨床上解決乳腺癌化療耐藥問題提供了體內實驗依據，對乳腺癌的治療具有一定的指導意義。

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(2013-11-18收稿 2014-01-20修回)

(責任編輯 武建虎)

Effectofadenovirus-mediatedp53genetherapyonreversingmultidrugresistanceinbreastcancerinvivoanditseffectonexpressionofP-gp

JI Nan, DONG Yi, TANG Xin, LIU Aihui, and WANG Gangyue. Department of Breast, Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital, Capital Medical University, Beijing 100026, China

ObjectiveTo study the effect of recombinant adenovirus mediated p53 gene on reversing multidrug resistance and expression of P-gp in MCF-7/ADR human breast cancer xenografts.MethodsMCF-7/ADR human breast cancer cells were injected into nude mice. The experimental mice with xenografts were randomized into groups of control, rAd-p53, adriamycin, rAd-p53+adriamycin. The growth of tumor was observed. Expression of P-gp in several groups was assessed by Western blotting.ResultsThe inhibitory rate after administration of rAd-p53, adriamycin, and rAd-p53+adriamycin were 42.05%，49.21%， and 69.97%, respectively. There was significant difference between all treatment groups and control group (P<0.05). And inhibition in group rAd-p53+adriamycin was more significant than inhibition in group rAd-p53 and group adriamycin. The expression of P-gp in groups of control, rAd-p53, adriamycin, rAd-p53+adriamycin were (0.5964±0.0806), (0.5506±0.0127), (0.5641±0.0055), and (0.4652±0.0982), respectively it was decreased significantly in group rAd-p53+Adriamycin.ConclusionsrAd-p53 can effectively reverse the multidrug resistance of MCF-7/ADR xenografts in nude mice. And it can inhibit the expression of P-gp.

breast cancer; P53 gene; multidrug resistance; P-glycoprotein

紀 楠，碩士，住院醫師，E-mail:vessica828@sina.com

100026，首都醫科大學附屬北京婦產醫院乳腺科

王鋼樂，E-mail: gangyue_wang@163.com

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