中晚期肝癌肝動脈栓塞化療是否聯合過繼T細胞免疫療法的療效比較

曹 亮，李 偉，盛 俊，彭 勛，彭 勇，郭聰珊，田 茹

中晚期肝癌肝動脈栓塞化療是否聯合過繼T細胞免疫療法的療效比較

曹 亮1，李 偉1，盛 俊1，彭 勛1，彭 勇2，郭聰珊2，田 茹2

目的觀察肝動脈栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)聯合過繼T細胞免疫療法對中晚期肝癌的近期療效，以及對外周血T淋巴細胞亞群及Treg細胞計數的影響。方法回顧分析114例中晚期原發性肝癌患者實行TACE聯合過繼T細胞療法(研究組)或單一TACE治療(對照組)的資料。研究組(56例)全部經過TACE術且術后第2天接受過繼T細胞回輸；對照組(58例)僅接受TACE治療。治療為每4周一次，最多不超過3次，觀察療程為2年。觀察無進展生存期(progress free survival, PFS)和總生存期(overall survival, OS)，以及治療前后相同時間點測定T淋巴細胞亞群、Treg細胞以及AFP計數變化。結果研究組與對照組的近期療效及AFP下降率比較，無統計學差異。研究組治療后6個月、1年、2年的無進展生存率分別是71.4%、23.2%、5.4%；對照組分別是65.5%、31.0%、3.4%。兩組中位疾病進展時間分別是8個月(95%CI，8-11個月)和5個月(95%CI，6-9個月)。研究組治療后6個月、1年、2年的總生存率分別是89.2%、71.4%、60.7%，對照組分別是70.6%、41.4%、17.2%。兩組中位生存期分別是18個月(95% CI，16-20個月)和11個月(95% CI，9-13個月)。研究組CD4+細胞比率由治療前(51.27±4.85)%升至(54.51±5.03)%，CD8+以及Treg細胞計數分別由(40.87±3.26)%和(6.36±0.98)%下降至(37.24±3.56)%和(3.89±0.31)%，CD4+/CD8+比值增大(P<0.05)；對照組治療后與治療前相比無統計學差異。結論中晚期肝癌患者TACE術后聯合過繼T細胞療法可提高無進展生存期和總生存期，并能提高免疫能力，增強機體的抗腫瘤效應，有可能降低中晚期肝癌患者的復發率和轉移率。

原發性肝癌；肝動脈化療栓塞；過繼T細胞療法；無進展生存期；總生存期；T淋巴細胞亞群；Treg細胞

原發性肝癌已成為世界范圍內的第五大腫瘤[1]，是我國腫瘤導致死亡的第二大原因。早期原發性肝癌的治療方法首選手術治療和肝移植，據報道，只有20%的原發性肝癌患者從中受益[2]。由于大部分肝癌患者就診時多屬于中晚期，已喪失了手術的最佳時機，對這類患者的治療國內外已經把肝動脈化療栓塞術(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)確定為最佳非手術治療手段之一。然而，應用TACE仍然有不能消滅腫瘤細胞和難以控制腫瘤復發的局限性[2-6]。

自體初始型T細胞(Na?ve T細胞)是過繼細胞療法的主要細胞來源，在體外由初始型T細胞制備效應性抗原特異性T細胞的程序與初始型T細胞轉化成效應性T細胞的體內生理過程基本一致。此療法是利用每個原發性肝癌患者自身的DC細胞誘導出具有其自身肝癌細胞抗原特異性T細胞，使肝癌患者個體化治療成為可能[7]，其免疫優勢是對腫瘤細胞的殺傷作用有持久性和特異性。Diego等[8]研究表明，聯合過繼T細胞免疫療法治療原發性肝癌小鼠模型，12個月存活率可達到100.0%，腫瘤消失率可達到100.0%，并且肝癌無復發。

本研究通過回顧114例中晚期原發性肝癌患者，主要評估TACE聯合過繼T細胞療法對中晚期肝癌患者的短期療效、免疫功能、無進展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS) 的影響。

1 資料與方法

1.1 資料 選擇我院從2007-01至2012-12收治的年齡超過18歲，經病理或臨床證實且病例資料完整的不能手術切除的原發性肝癌患者114例，且實行TACE聯合過繼T細胞療法或單一TACE治療?；颊咭话銧顩r良好，ECOG評分0～2分，其中103例(90.4%)HBsAg陽性，所有患者外周血白細胞計數均>3.0×1012，血小板計數>100×109，腫塊直徑為4～10 cm，無淋巴結轉移，無遠處轉移。所有患者按照2002年國際抗癌聯盟(UICC)分期為Ⅱ期或Ⅲa或Ⅲb期；Child-Pugh A級103例(90.3%)，B級11例(9.6%)。依據患者意愿，56例患者接受TACE聯合過繼T細胞療法，作為研究組。另58例患者僅接受TACE治療，作為對照組。全部患者治療前均簽署知情同意書。兩組患者治療前60 d均未接受任何放化療或影響免疫功能的藥物。研究組男50例，女6例，平均(52.0±4.1)歲；對照組男50例，女8例，平均(51.0±3.4)歲。兩組病例臨床分期及腫瘤分級等比較，差異無統計學意義(表1)。

1.2 儀器和主要試劑 流式細胞儀(美國BD公司)，二氧化碳培養箱(珠海市再鑫儀器有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，低速離心機(北京醫用離心機廠)。流式細胞抗體：CD3單克隆抗體、CD4單克隆抗體、CD8單克隆抗體、淋巴細胞分離液、白細胞因子，均為美國ABCAM公司產品。培養基及培養皿均為Corning公司產品。

1.3 方法

1.3.1 TACE 采用Seldinger穿刺插管技術，局部麻醉，經皮右股動脈穿刺，導管選擇至腫瘤供血動脈行DSA造影，根據腫瘤血供情況進行栓塞。TACE藥物選擇吡柔比星30～50 mg，喜樹堿5 mg，碘化油10～20 ml，碘海醇5～10 ml。每4周治療1次，最多不超過3次。

1.3.2 過繼T細胞制備 抽取40 ml患者外周富集血，經淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，用含10%人AB型血清的1640培養液調整細胞濃度為(1～3)×106/ml，放入二氧化碳培養箱進行培養。第1天加入人重組白介素(IL-1α)100 U/ml、人重組干擾素(IFN-γ)100 U/ml，培養第2天加入人重組IL-2 500 U/ml，第4天、第5天分別加腫瘤壞死因子(TNF)3000 U/ml。每3 d更換新鮮培養液，培養7 d后，收獲細胞，50%回輸給患者，同日抽取患者40 ml外周血，加入剩余50%細胞中再次培養7 d，方法同上。

1.3.3 過繼T細胞回輸 治療組在TACE術當天回輸第2次培養的過繼T細胞給患者，細胞數在(0.01～1)×108，整個回輸過程保持在30 min內完成。30 d為一療程，1年不超過4個療程。

1.4 療效評價 檢測研究組與對照組治療前1周及治療后2周患者外周血AFP、T淋巴細胞(CD4+、CD8+)和CD4+、CD25+Treg細胞等免疫指標水平的變化。療效評價依據CT或MRI 檢查，確定腫瘤縮小的程度，根據WHO實體腫瘤療效評價標準療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)、疾病進展(PD)，客觀有效率為CR+PR。計算無進展生存率和總生存率。

2 結 果

2.1 近期療效 治療后，研究組56例中，CR、PR、SD和PD分別為 8、40、5和3例；對照組58例中，分別為4、30、18和6例。研究組有效率85.7%，高于對照組有效率58.6%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 T淋巴細胞亞群及Treg細胞的變化 研究組治療后與治療前相比，CD4+T細胞增多，CD8+T細胞減少，CD4+/CD8+比值增大，Treg細胞減少(P<0.05)；而對照組患者治療后與治療前相比無統計學差異(表2)。

注：與治療前比較，①P<0.05；與對照組比較，②P<0.05

2.3 隨訪 平均隨訪時間為24個月(6～33個月)。114例均死亡，死亡原因為腫瘤復發、遠處轉移、肝衰竭、上消化道大出血。研究組6個月、1年和2年無進展生存率和總生存率與對照組進行對比，研究組的無進展生存率和總生存率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01，表3)。

注：與對照組比較，①P<0.01

2.4 不良反應 研究組(56例患者)治療后1周內出現疼痛20例次(35.7%)，發熱12例次(21.4%)，白細胞計數減少3例次(5.3%)，肝功能損害0例次(0%)，不良反應共計35例次(62.5%)；對照組(58例患者)中出現疼痛35例次(60.3%)，發熱20例次(34.5%)，白細胞計數減少6例次(10.3%)，肝功能損害2例次(3.4%)，共計63例次(108.6%)；研究組的不良反應發生率低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。上述不良反應經過對癥處理后均緩解或消失。

3 討 論

原發性肝癌在治療上，通常采取手術、放療、化療、介入治療、直線加速器、伽馬刀、射頻消融術、中醫等療法，但晚期患者因癌細胞擴散而治愈率低。半個世紀以來，世界各國肝癌的發病率和病死率都呈現增高的趨勢，到目前為止，肝癌的治療效果仍不滿意。雖然手術和肝移植仍是肝癌的首選治療方法，但由于大部分患者發現時已是晚期，而且肝源缺乏也限制了肝移植的實施。

目前TACE最常用于肝癌的治療，包括肝動脈插管化療栓塞和肝動脈插管化療灌注。TACE作為不可切除晚期肝癌的的首選治療方法，在世界范圍內已得到了廣泛運用，并取得了較好療效。由于大部分原發性肝癌的血供來源于肝動脈，所以TACE可使化療藥物在腫瘤組織首次濃度達到100%。然后，部分藥物經過靶器官靜脈回流進入體循環，這時相當于藥物從靜脈注入，從而導致癌細胞的凋亡[9]。研究發現，TACE法也有缺陷，TACE的缺點就在于不能完全殺死肝癌細胞。肝癌患者均具有免疫缺陷，這與肝癌不易控制甚至易復發也有很大關系。

本研究應用TACE療法聯合過繼T細胞免疫療法，即應用栓塞、化療與免疫聯合療法，對中晚期肝癌的近期療效，以及外周血T淋巴細胞亞群和Treg細胞計數進行了觀察和分析。結果顯示，TACE后聯合過繼T細胞免疫療法與單純TACE治療法比較，中晚期肝癌的近期療效、無進展生存期以及總生存期均有提高(P<0.05)，表明TACE后聯合過繼T細胞免疫療法對于中晚期肝癌的治療效果優于單純TACE治療法。AFP是原發性肝癌的高特異性和高靈敏度的腫瘤標志物，肝癌患者的AFP常常明顯升高。但是，在本研究中兩組AFP下降率相比較無統計學差異，可能原因是大約80%成人的肝癌血清AFP才出現升高，而且腫瘤與腫瘤標志物之間只是一種相關性的關系，并不是一一對應的關系，也就是說，肝癌狀況的變化不一定引起AFP的明顯改變。

根據《流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南》，CD4+T細胞減少或CD8+T細胞增多可見于惡性腫瘤。CD4+/CD8+比值是免疫調節的一項重要指標，正常值1.4～2.0，若其比值<1.4可見于惡性腫瘤。在本研究中，研究組患者治療后與治療前相比，CD4+T細胞增多、CD8+T細胞減少、CD4+/CD8+比值增大且>1.4、Treg細胞減少(P<0.05)；而對照組患者治療后與治療前相比無統計學差異。結果表明，研究組的療效優于對照組，TACE聯合過繼T細胞免疫療法具有較好的治療作用。

有研究發現，Treg浸潤多和CD8+細胞毒性T淋巴細胞的高表達是肝癌患者預后差的反映，與肝癌疾病進展有關[10，11]。如果應用小劑量的化療藥物清除腫瘤微環境中的抑制性細胞(主要是Treg細胞)，可以增加抗肝癌患者的療效[12]。由此可以解釋TACE后聯合過繼T細胞療法可以提高患者的近期療效、無進展生存期和總生存期，本課題結果也證實了這個學術觀點。另外，從臨床觀察來看，TACE術后采用過繼免疫T細胞療法的肝癌患者耐受性好，不良反應小。

從免疫學方面看，在固有的NK與NKT細胞有一定的殺傷癌細胞的作用，但是徹底清除癌細胞，需依靠抗原特異性T細胞介導的適應性細胞免疫反應[13，14]，未來良好而有效的過繼細胞療法的免疫細胞必須來自T細胞[15]。TACE能夠清除局部腫瘤本身，過繼T細胞免疫療法又能夠清除機體殘留的微小病灶。這兩種方法結合，既針對了局部腫瘤的治療又改善了抑制性免疫微環境，可達到個體化全身治療的目的。

總之，本研究表明，TACE聯合過繼T細胞療法，在短期內可以提高機體抗腫瘤的免疫能力，從而提高了患者的無進展生存期和總生存期。

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(2013-11-11收稿 2014-02-14修回)

(責任編輯 武建虎)

WhetherthesystemictranscatheterarterialchemoembolizationoughttocombinewithadoptiveTlymphocytesfortheadvanced-stagehepatocellularcarcinoma:acomparativestudy

CAO Liang1, LI Wei1, SHENG Jun1, PENG Xun1, PENG Yong2, GUO Congshan2, and TIAN Ru2. 1. Department of Medical Oncology, Qinhuangdao No.3 Hospital, Qinhuangdao 066000, China; 2. Department of Biomedical Engineering, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, China

ObjectiveTo study the different affects of TACE alone and TACE combined with adoptive T lymphocytes on the peripheral T lymphocyte subsets and Treg cells for advanced hepatocellular carcinoma(HCC).Methods114 patients with advanced stage HCC were recruited, 56 patients were treated with TACE followed by adoptive T lymphocytes treatment，and 58 patients were treated with TACE only as a control group. Each patient was treated once a month, successive 3 times were a course of treatment. The duration of the observation was 2 years. The progress free survival(PFS) and overall survival(OS), serum levels of AFP, T lymphocyte sunsets and Treg cells in peripheral blood of advanced HCC patients were found out before and after the treatments.ResultsThe short-term responses in the 2 groups were similar. There was also no significant difference in the reduction rates of AFP between these two groups. The 6 months, 1 year, and 2 years PFS rates were 71.4%, 23.2%, 5.4% in combination group, and 65.5%, 31.0%, 3.4% in control group. The median TTP (time to progression)was 8 months (95% confidence interval CI，8-11 months) for combination group and 5 months(95% confidence interval CI，6- 9 months) for control group. The proportion of 6 months, 1 year, and 2 years OS were 89.2%, 71.4% and 60.7% in combination group, while in control group they were 70.6%, 41.4%, 17.2%(P<0.05) , respectively. The median survival time was 18 months(95% CI，16-20 months)in combination group and 11 months(95% CI，9-13 months)in control group. In the study group, the percentage of CD4+increased from(51.27±4.85)% to(54.51±5.03)% (P<0.05), CD8+and Treg cells decreased from (40.87±3.26)%，(6.36±0.98)% to (37.24±3.56)%,(3.89±0.31)% (P<0.05), respectively. The rates of CD4+/CD8+increased greatly(P<0.05). There was no significant difference compared between before and after treatment in the control group.ConclusionsAdjuvant immunotherapy with adoptive T lymphocytes may prolong the PFS and OS in advanced HCC patients, and there is a statistically significant difference. It can improve immunological status as well as the efficacy of TACE in these patients. It may also play an important role in reducing the recurrence and metastases in HCC patients.

hepatocellular carcinoma; transcatheter arterial chemoembolization; adoptive T lymphocytes; progression free survival; overall survival; T lymphocyte subset; Treg cells

秦皇島市2012年科學技術研究與發展計劃項目(編號：2012023A217)

曹 亮，碩士，主治醫師，E-mail：drcaol@hotmail.co.uk

1. 066000，秦皇島市第三醫院腫瘤科; 2. 066004秦皇島, 燕山大學生物醫學工程系

彭 勇，E-mail：PY81@sina.com

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