畢赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化合成APG的工藝條件優(yōu)化

胡霞艷 劉端玉 鄭穗平

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

畢赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化合成APG的工藝條件優(yōu)化

胡霞艷 劉端玉 鄭穗平

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

使用畢赤酵母細(xì)胞表面展示棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶作為全細(xì)胞催化劑，以葡萄糖為底物，在水-醇雙相體系中逆水解合成C6-C10烷基糖苷。討論了含水量、葡萄糖添加量、全細(xì)胞催化劑添加量、乙酸-乙酸鈉緩沖液pH值和溫度等主要因素對(duì)反應(yīng)的影響，并與商品酶苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Novozym188不適合逆水解合成APG，苦杏仁β-葡萄糖苷酶反應(yīng)所需時(shí)間短，但最終轉(zhuǎn)化率不如全細(xì)胞催化劑。在 5 mL反應(yīng)體系中，合成HG的最優(yōu)條件：葡萄糖0.1 g，全細(xì)胞催化劑0.05 g，10% pH 3.0 buffer；合成OG的最優(yōu)條件：葡萄糖0.2 g，全細(xì)胞催化劑0.05 g，15% pH3.0 buffer；合成DG的最優(yōu)條件：葡萄糖0.2 g，全細(xì)胞催化劑0.2 g，20% pH 3.0 buffer；放置55℃ 200 r/min 恒溫振蕩器中，反應(yīng)時(shí)間為72 h，HG和DG的最大產(chǎn)率分別為11.69%和3.58%，而OG的產(chǎn)率則在96 h到達(dá)最大值6.34%。

細(xì)胞表面展示 β-葡萄糖苷酶 全細(xì)胞催化劑 烷基糖苷

烷基糖苷（Alkyl polyglycoside，APG）是生物降解迅速且徹底，無毒低刺激的“綠色”表面活性劑。它不僅具有表面張力低，泡沫豐富而穩(wěn)定，去污性優(yōu)良，而且配伍性能極佳，可廣泛于洗滌劑、化妝品、農(nóng)藥、紡織等行業(yè)，是下一代新型表面活性劑最有希望的品種之一［1］?；瘜W(xué)合成法是合成APG的傳統(tǒng)方法，但是由于化學(xué)法需要選擇性保護(hù)基團(tuán)，激活和耦合等步驟，不僅耗時(shí)長，還不可避免地存在副反應(yīng)。過去的十多年中利用酶法合成糖苷和低聚糖成為研究熱點(diǎn)，因?yàn)槊阜ê铣葾PG具有很多化

學(xué)法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，例如，不需要保護(hù)-去保護(hù)過程，具有較好的區(qū)域選擇性和立體專一性，可以避免異頭物的產(chǎn)，反應(yīng)條件溫和產(chǎn)物雜質(zhì)少且易于純化。在水-醇雙相體系中，酶促逆水解反應(yīng)合成糖苷只需一步，因此可以大大節(jié)省后續(xù)的產(chǎn)物提取成本，因而受到人們的廣泛關(guān)注［2，3］。

棘孢曲霉生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶，既可以水解可溶性纖維寡糖，也可以水解不溶性纖維寡糖［4］。一直以來相關(guān)研究報(bào)道都是圍繞纖維素水解，用于合成APG的研究仍處于探索階段。近些年，酵母表面展示技術(shù)得到了迅速的發(fā)展［5］，其中巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）作為一種新型的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)量高分泌能力強(qiáng)，生長快和操作簡便等特點(diǎn)，還具有真核細(xì)胞翻譯后的加工和修飾功能，適合表達(dá)需翻譯后修飾的外源蛋白。它能將外源A-BGL以融合蛋白的形式展示在細(xì)胞的表面，保持A-BGL原有的生物活性和相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象，因此展示有A-BGL的酵母細(xì)胞可以作為全細(xì)胞催化劑表現(xiàn)出耐溫、耐有機(jī)溶劑和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性。韋斌如等［6］在畢赤酵母細(xì)胞表面成功展示了A-BGL，并初步用于催化合成APG。

本研究利用棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶重組畢赤酵母菌株GS115/pKFS-ABGL作為全細(xì)胞催化劑，在水-醇雙相體系中逆水解合成APG，并探討含水量、葡萄糖添加量、全細(xì)胞催化劑添加量、乙酸-乙酸鈉緩沖液pH值和溫度等主要因素對(duì)反應(yīng)的影響，并根據(jù)對(duì)影響大小確定主次影響因素，為后續(xù)工藝優(yōu)化試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶重組畢赤酵母菌株GS115/pKFS-ABGL由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存，Novozym 188購于諾維信，游離苦杏仁β-glucosidase購自Sigma。對(duì)硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNPG）、己基β-D-葡萄糖苷（HG）、辛基β-D-葡萄糖苷（OG）、癸基β-D-葡萄糖苷（DG）、購自Sigma公司；其它試劑均為市售試劑。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母表面展示棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶催化劑的制備 棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶重組畢赤酵母菌株GS115/pKFS-ABGL培養(yǎng)于 YPD 瓊脂固體平板上，培養(yǎng)24 h后接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min 培養(yǎng) 24 h，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY 培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min 24 h，然后在4℃、8 000 r/min 離心10 min 得到菌體，轉(zhuǎn)入 BMMY培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min 培養(yǎng) 5 d，每隔 24 h 加入0.5%（V/V）甲醇誘導(dǎo)。然后收集發(fā)酵菌體，離心，用雙蒸水洗兩次，最后用少量雙蒸水重懸，通過真空冷凍干燥得到全細(xì)胞催化劑干粉。培養(yǎng)基均按 Invitrogen 公司畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)配方配制。

我們首先從GPS數(shù)據(jù)中去除事件前的偏移。然后我們假設(shè)加速度儀每個(gè)分量的基線誤差是時(shí)間的函數(shù)，并一般可用線性函數(shù)結(jié)合正弦函數(shù)表示：

1.2.2 GS115/pKFS-ABGL凍干酶粉逆水解合成APG在水-有機(jī)構(gòu)成的5 mL體系中以葡萄糖為底物逆水解合成APG，分別探討了含水量、葡萄糖添加量、全細(xì)胞催化劑添加量、乙酸-乙酸鈉緩沖液pH值和溫度等主要因素對(duì)反應(yīng)的影響，并優(yōu)化反應(yīng)條件。最后在相同的反應(yīng)條件下，比較實(shí)驗(yàn)室自制的全細(xì)胞催化劑GS115/pKFS-ABGL凍干酶粉和商品酶苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188合成HG、OG和DG的催化效率。

1.2.3 GS115/pKFS-ABGL凍干酶粉合成APG的操作穩(wěn)定性 全細(xì)胞催化劑的預(yù)處理：取全細(xì)胞催化劑于丙酮中，置于恒溫?fù)u床中55℃，200 r/min，放置24 h。離心除去有機(jī)溶劑丙酮，收集酶粉，于30℃恒溫箱中放置24 h。然后取全細(xì)胞催化劑用于催化合成HG、OG和DG。反應(yīng)72 h后的反應(yīng)液，離心去掉上清，酶粉用丙酮洗兩次，收集得到全細(xì)胞催化劑，置于30℃恒溫箱中放置24 h，重復(fù)用于催化合成HG、OG和DG，如此重復(fù)使用5次。

1.2.4 HPLC-ELSD定量分析 APG APG的檢測(cè)采用Waters 2695型高效液相色譜儀。色譜條件：色譜柱Zorbax SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm i.d），流速1 mL/min，柱溫30℃，2424 型ELSD 檢測(cè)器，進(jìn)樣量10 μL，漂移管溫度55℃，氮?dú)饬魉?0 psi。以APG的標(biāo)準(zhǔn)品，制作校正曲線，并根據(jù)保留時(shí)間定性。HG和OG檢測(cè)均用流動(dòng)相甲醇∶水=80∶20，葡萄糖、HG和OG的保留時(shí)間分別為3.46 min，4.80 min，6.08 min。DG檢測(cè)用流動(dòng)相甲醇∶乙酸乙酯∶水=48∶39∶13，葡萄糖和DG的保留時(shí)間分別為3.04 min 和3.98 min。

APG的產(chǎn)率=Mg/Me ×100%

式中，Me：反應(yīng)體系中APG的質(zhì)量，Mg：反應(yīng)體系中葡萄糖的質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 含水量對(duì)全細(xì)胞催化劑合成APG的影響

圖1 含水量對(duì)全細(xì)胞催化劑合成APG的影響

2.2 葡萄糖和全細(xì)胞催化劑添加量對(duì)全細(xì)胞催化劑合成APG的影響

如圖2所示，APG的轉(zhuǎn)化率隨葡萄糖添加量的變化有相同的趨勢(shì)，先升后降。HG最佳的添加葡萄糖量為0.1 g，繼續(xù)增加葡萄糖量，轉(zhuǎn)化率略會(huì)降低。中長鏈的OG和DG的合成需要更多的底物作為驅(qū)動(dòng)力，最佳葡萄糖添加量比HG的高，添加0.2-0.3g葡萄糖，轉(zhuǎn)化率相似，為了節(jié)約成本，均可取最優(yōu)葡萄糖添加量為0.2 g?？傮w來說，因?yàn)锳PG含量并沒有隨著葡萄糖添加量增加而發(fā)生變化，所以產(chǎn)率會(huì)下降。

優(yōu)化酶量對(duì)于減少反應(yīng)時(shí)間以及過程中的成本是非常重要的。從圖3中可以看出，隨著酶濃度的增加，APG的產(chǎn)率提高。當(dāng)全細(xì)胞催化劑用量大于0.05 g，再增加全細(xì)胞催化劑用量HG和OG產(chǎn)率變化較小。而當(dāng)全細(xì)胞催化劑用量超過0.1 g 時(shí)，HG卻有一定量的下降。原因可能是過多的酶粉會(huì)使傳質(zhì)阻力增大［17］。而對(duì)于合成DG而言，在全細(xì)胞催化劑添加量低于0.075 g 時(shí)，幾乎不能檢測(cè)到DG。而在全細(xì)胞催化劑添加量由0.075 g 增加到0.2 g 時(shí)，產(chǎn)率增加顯著。此后體系中全細(xì)胞催化劑添加量繼續(xù)增加，催化劑很難維持均勻懸浮狀態(tài)，存在傳質(zhì)阻力，而且酶濃度過高也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的水解加劇。所以在該反應(yīng)中0.2 g 是比較合適的全細(xì)胞催化劑添加量。

圖2 葡萄糖添加量對(duì)全細(xì)胞催化劑合成APG的影響

圖3 全細(xì)胞催化劑添加量對(duì)APG合成的影響

2.3 乙酸-乙酸鈉緩沖液pH值對(duì)A-BGL合成APG的影響

如圖4所示，反應(yīng)體系的pH值對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)PG產(chǎn)率影響較大，當(dāng)乙酸-乙酸鈉緩沖液pH 值為3時(shí)，A-BGL催化合成APG的產(chǎn)率最高。當(dāng)以水楊苷為底物時(shí)，A-BGL的最適pH為4.0-4.5。但從本試驗(yàn)所得結(jié)果看，A-BGL通過展示畢赤酵母表面在其對(duì)酸度適應(yīng)性比較強(qiáng)，可適應(yīng)的pH值范圍較廣。

2.4 溫度對(duì)A-BGL合成APG的影響

圖4 乙酸-乙酸鈉緩沖液pH值對(duì)合成APG的影響

從圖5中可以看出，溫度對(duì)反應(yīng)體系的APG產(chǎn)率有較大的影響，隨著溫度的變化APG產(chǎn)率會(huì)有著明顯的變化規(guī)律；從30℃到50℃的溫度區(qū)間內(nèi)APG產(chǎn)率隨著溫度的增加而增大，50℃時(shí)HG產(chǎn)率達(dá)到最大值11.84%。但是隨著反應(yīng)溫度到達(dá)60℃時(shí)其產(chǎn)物濃度和產(chǎn)率卻降低了，可能是棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶在高溫下變性而失活，酶促反應(yīng)速度下降。同時(shí)溫度對(duì)反應(yīng)影響也依賴于介質(zhì)成分，在合成OG和DG時(shí)，反應(yīng)溫度從50℃上升到55℃，其產(chǎn)率增加趨勢(shì)均相對(duì)較大，55℃為其最佳反應(yīng)溫度。

圖5 溫度對(duì)A-BGL合成APG的影響

2.5 全細(xì)胞催化劑、游離苦杏仁β-葡萄糖苷酶和Novozyme 188催化合成APG的比較

從圖6中可以看出在等酶活的條件下，全細(xì)胞催化劑與商品化苦杏仁β-葡萄糖苷酶、Novozym188在合成APG效率上比較。由于Novozym188屬于纖維素二糖酶，不適合于逆水解反應(yīng)，催化合成APG效果較差，尤其是對(duì)于長鏈脂肪醇而言。由于苦杏仁β-葡萄糖苷酶是游離酶，全細(xì)胞催化劑比酶活小，單位重量酵母細(xì)胞表面展示的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶蛋白較苦杏仁β-葡萄糖苷酶要少。體系處于等酶活的條件，加入酶量較少，杏仁β-葡萄糖苷酶能較好分散在水中，混合均勻，傳質(zhì)阻力相對(duì)較小。所以在催化合成APG時(shí)，6 h 時(shí)產(chǎn)率就到達(dá)最大值，之后變化不大。相比之下，全細(xì)胞催化劑都所需的反應(yīng)時(shí)間要長一些，但最終的產(chǎn)率全細(xì)胞催化劑要略高于商品化苦杏仁β-葡萄糖苷酶。由此可以通過提高展示系統(tǒng)蛋白表達(dá)量，進(jìn)行畢赤酵母的高密度發(fā)酵，提高單位干重細(xì)胞酶活，可以進(jìn)一步提高其催化合成APG的效率。

圖6 OG合成的反應(yīng)曲線

2.6 全細(xì)胞催化劑合成APG的操作穩(wěn)定性

酶的操作穩(wěn)定性是全細(xì)胞催化劑的重要特性之一，它直接影響著連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)過程和生產(chǎn)成本。如圖7，全細(xì)胞催化劑有較好的操作穩(wěn)定性。在反應(yīng)5批次后，APG的相對(duì)產(chǎn)率變化不大略有下降，其中反應(yīng)2批次均逐步增加。

圖7 全細(xì)胞催化劑合成APG的操作穩(wěn)定性

3 討論

反應(yīng)體系中含水量對(duì)APG的逆水解合成有較大的影響，Ito等［7］也報(bào)道在釀酒酵母細(xì)胞表面展示的A-BGL催化以pNPG為底物轉(zhuǎn)糖苷合成APG時(shí)，當(dāng)含水量為5%時(shí)，幾乎不能合成HG，其最佳含水

量為20%。因?yàn)樗粌H對(duì)維持酶的構(gòu)象起著重要作用，而且作為溶劑能溶解底物葡萄糖，但是過多的水便會(huì)阻礙反應(yīng)向生成APG的方向進(jìn)行，導(dǎo)致APG產(chǎn)率下降，所以對(duì)反應(yīng)平衡影響很大，APG的最終產(chǎn)率是由兩個(gè)反應(yīng)之間的比例決定的［8］。

理論上底物葡萄糖的提高應(yīng)有利于反應(yīng)向合成方向的推動(dòng)，從而提高APG的產(chǎn)物濃度，但事實(shí)證明，增加葡萄糖濃度反而會(huì)使產(chǎn)物濃度略有下降，產(chǎn)率顯著下降［9］。APG濃度降低主要是因?yàn)槠咸烟堑臐舛冗^高會(huì)對(duì)β-葡萄糖苷酶的活性起到抑制作用。在已被研究的β-葡萄糖苷酶中，絕大多數(shù)β-葡萄糖苷酶被葡萄糖強(qiáng)烈抑制［10-12］，而且在極低濃度的葡萄糖就能抑制β-葡萄糖苷酶活性［13］。通常葡萄糖對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的抑制常數(shù)Ki為0.2-100 mmol/L［14，15］，也有極少數(shù)來自酵母和真菌的β-葡萄糖苷酶，其對(duì)葡萄糖的抑制常數(shù)超過200 mmol/L［16，17］。Vulfson等［18］報(bào)道了在1-己醇為20 mL，添加的葡萄糖為1 mmol（0.18 g）時(shí)產(chǎn)率最大。

溫度是酶促反應(yīng)又一個(gè)重要因素之一，因?yàn)闇囟炔粌H影響底物的溶解度，也影響酶活。Ito等報(bào)道了棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷催化HG時(shí)，50℃的產(chǎn)率明顯高于30℃的。這是由于提高反應(yīng)溫度可以提高底物葡萄糖的溶解度，降低脂肪醇介質(zhì)黏度，增加雙相反應(yīng)體系中各相的相容性，使合成反應(yīng)容易進(jìn)行。本試驗(yàn)合成APG的最適溫度為55℃，這與周亞軍［19］報(bào)道的固定酶催化合成OG的反應(yīng)中，溫度對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響相一致。

展示在畢赤酵母表面的A-BGL類似于固定化酶，相比游離酶耐酸性更強(qiáng)，操作穩(wěn)定性強(qiáng)，可回收利用。本研究全細(xì)胞催化劑重復(fù)利用了5次，轉(zhuǎn)化率幾乎不變，這與任昌瓊［20］報(bào)道在有機(jī)溶劑中用表面展示南極假絲酵母脂肪酶B合成果糖酯的操作穩(wěn)定性的結(jié)果相似。脂肪醇和乙酸-乙酸鈉緩沖液可能有助于酶表面形成一層結(jié)構(gòu)水膜，對(duì)酶有一定的保護(hù)作用，從而增加其熱穩(wěn)定性。由此可知全細(xì)胞催化劑具有良好的水-醇雙相體系穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，為進(jìn)一步擴(kuò)大化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過試驗(yàn)探討了幾種主要單因素對(duì)全細(xì)胞催化劑GS115/pKFS-ABGL在水-醇雙相體系中逆水解催化合成APG產(chǎn)率的影響，并進(jìn)行優(yōu)化。合成不同碳鏈的APG最適條件有所不一樣，但總體變化趨勢(shì)相同。在0-24 h 內(nèi)，全細(xì)胞催化劑催化合成APG的合成速率較低，隨著APG合成速率迅速增加，72 h后達(dá)到最大產(chǎn)率，其中HG和DG的產(chǎn)率分別為11.69%和3.58%，而OG產(chǎn)率在96 h 才到達(dá)最大值6.34%。雖然苦杏仁β-葡萄糖苷酶催化合成APG較好的轉(zhuǎn)化率，但是成本較高。

采用畢赤酵母展示的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶能極大降低酶的應(yīng)用成本，該酶具有與苦杏仁酶相當(dāng)甚至略高的轉(zhuǎn)化率。此外，畢赤酵母展示的全細(xì)胞催化劑GS115/pKFS-ABGL有較好的操作穩(wěn)定性，在反應(yīng)5批次后，APG的相對(duì)產(chǎn)率變化不大，可以為酶工業(yè)化生產(chǎn)APG大大節(jié)省了生產(chǎn)成本，具備較好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of the Synthesis of Alkyl Glucoside Catalyzed by Aspergillus aculeatus β-glucosidase-displaying Pichia pastoris Whole-cells

Hu Xiayan Liu Duanyu Zheng Suiping
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）

Aspergillus aculeatus β-glucosidase displayed Pichia pastoris cell surface was used as whole-cell biocatalyst, glucose as substrate, catalyzed synthesis alkyl glucosides of C6-C10 with reverse hydrolysis in water-alcohol two-phase system. The effects of various reaction factors, including water content, whole-cell biocatalyst dose, glucose concentration, pH and temperature were optimized. The catalytic effect of whole-cell biocatalyst were compared with commercial enzyme almond β-glucosidase and Novozym188 . The results showed that Novozym188 was not suitable for synthesis of APG, almond β-glucosidase need shorter time than whole-cell biocatalyst, but the final conversion of whole-cell biocatalyst was higher. In 5 mL total reaction volume, the optimal reaction conditions of HG：0.1 g glucose, 0.05 g whole-cells biocatalyst, 10% pH3.0 buffer；the optimal reaction conditions of OG：0.2 g glucose, 0.05 g whole-cells biocatalyst, 15% pH3.0 buffer；the optimal reaction conditions of DG：0.2 g glucose, 0.2 g whole-cells biocatalyst, 20% pH3.0 buffer, temperature 55℃, 200 r/min. After 72 h the maximum HG and DG yield could be 11.69% and 3.58%. The highest yield of OG was 6.34% after 96 h.

Cell surface displaying β-glucosidase Whole-cell biocatalyst Alkyl glucosides

2013-12-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171633），廣東省工業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2010B011000004）

胡霞艷，女，碩士，研究方向：酶與酶應(yīng)用；E-mail：lucksnail@163.com

鄭穗平，男，博士，教授，研究方向：酶工程；E-mail：spzheng@scut.edu.cn