轉染RNF6基因對肝癌細胞IRS-2表達的影響

鞏健 宋健

（淄博職業學院制藥與生物工程系，淄博 255314）

轉染RNF6基因對肝癌細胞IRS-2表達的影響

鞏健 宋健

（淄博職業學院制藥與生物工程系，淄博 255314）

構建環指蛋白6（RNF6）真核表達載體，并探討其對胰島素受體底物1（IRS-2）表達的影響。以人cDNA為模板，PCR擴增RNF6 全長編碼基因，并將其克隆至載體pcDNA3.1-CHA中，將重組質粒轉染肝癌細胞株HepG2，利用Real time-PCR、Western blot檢測細胞內IRS-2 mRNA水平及蛋白表達情況。攜帶RNF6目的基因的質粒轉染HepG2細胞48 h后IRS-2的mRNA表達降低，為對照組的37%，顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。 RNF6引起IRS-2的表達下調，這一過程可能由于泛素化導致胰島素信號轉導通路障礙。

胰島素受體底物-2 泛素化 環指蛋白6 胰島素

全世界每年新發肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第5位。肝源性糖尿病是其一種常見的并發癥，外周胰島素抵抗是導致肝源性糖尿病的主要原因［1］。胰島素與其受體結合后，磷酸化胞內胰島素受體底物（Insulin receptor substrate，IRS），從而產生一系列生理生化反應［2］。IRS-2作為一種船塢蛋白在胰島素/類胰島素生長因子信號通路中發揮非常重要的作用［3，4］。胰島素受體底物蛋白是胰島素經典信號通路中的一個關鍵因子，參與調控胰島素受體后水平的許多生理過程。泛素化是胞內蛋白質轉錄后修飾的重要方式，整個細胞質膜系統（從細胞膜、內質網到核膜等）都存在泛素化底物及其降解過程［5］。有研究［6，7］表明，細胞內蛋白質去泛素化與泛素化過程與惡性腫瘤發生有密切關系，認識理解此降解過程與分子機制，對治療由泛素系統功能紊亂引起的各種疾病具有重要作用。泛素活化酶E1、泛素結合酶E2 和泛素連接酶E3共同介導細胞內泛素化反應，其中連接酶E3能特異識別相關底物，由此決定泛素-蛋白酶體系統（UPS）蛋白降解的特異性，所以連接酶E3引起科研工作者的廣泛關注［8］。環指蛋白6（Ring finger protein 6）作為泛素連接酶E3，結合E2從而降解相應靶蛋白［8］。因此，本研

究構建人RNF6全長基因的真核表達載體，轉染肝癌細胞HepG2研究RNF6對IRS-2表達的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2由中科院上海生命科學研究院提供；pcDNA3.1載體、DNA連接酶、EcoR I和BamH I均購自TaKaRa公司；4XdNTP、TaqDNA聚合酶購自美國Promega公司；Lipofecter脂質體轉染試劑購自碧云天；質粒提取、RNA提取及膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司；Marker-DL2000購自上海生工；HRP標記的β-actin內參購自上海康成生物；Anti-IRS-2抗體購自美國Upstate公司；羊抗兔IgG二抗購自美國SouthernBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達質粒的構建 針對人RNF6的序列設計并合成PCR 引物，在引物序列中分別添加Hind III酶切位點（引物1：5'- ATC AAGCTTatgaatcagtctagatcga- 3'）和SalI酶切位點（引物2：5'-ATC GTCGACcccattgtttgctatgttag- 3'），以人cDNA為模板擴增RNF6，PCR反應條件為：98℃預變性1 min，98℃變性10 s，50℃復性15 s，68℃延伸15 s，30個循環。將PCR產物和真核表達載體pcDNA-CHA分別用Hind III、SalI雙酶切，酶切產物凝膠回收純化后用T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接液轉化感受態大腸桿菌DH5α擴增，涂布LB瓊脂平板后37℃培養過夜，挑取單克隆再在LB試管中37℃振蕩培養過夜。按試劑盒說明書抽提質粒，用Hind III、SalI雙酶切鑒定重組質粒，并送去上海生工進行測序。

1.2.2 細胞培養與分組 在含CO25%、37℃恒溫培養箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養人肝癌細胞株HepG2，每隔1-2 d傳代一次。按轉染試劑盒說明書進行轉染。試驗細胞分為3組：即空白對照組（不做任何處理的HepG2）、轉染空載質粒組、轉染組。

1.2.3 Real-time PCR 檢測 收集轉染后48 h的細胞及未轉染細胞，用Trizol提取細胞總RNA，使用MMLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA 以各組cDNA為模板，加入緩沖液引物等進行PCR，各樣本重復3次。反應條件：95℃ 30 s預變性，94℃ 30 s，60℃退火30 s，72℃ 1 min，40個循環，72℃ 7 min。PCR結束后加入上樣緩沖液后對產物進行1.5%的瓊脂糖電泳，凝膠成像系統觀察結果。反應結束后根據定量PCR的擴增曲線和溶解曲線分析相關基因的表達情況。

1.2.4 Western blot檢測 IRS-2蛋白表達 轉染后48 h收集細胞及未轉染細胞，用蛋白裂解液處理細胞提取蛋白樣品，蛋白樣品經10%的SDS-PAGE分離后，恒流200 mA轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，之后加入相應的一抗、二抗進行孵育并洗膜，ECL試劑發光檢測目標蛋白的表達情況。

1.2.5 統計分析 相關數據處理運用SPSS17.0，以均數±標準差（x-±s）表示計量資料，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 目的片段的獲取

經PCR擴增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行產物鑒定，在約2 000 bp處有目的條帶，目的片段大小與預期擴增的基因片段大小一致，見圖1。

圖1 目的基因RNF6的PCR擴增

2.2 陽性克隆的鑒定

將重組質粒轉化E coli.DH5α，篩選陽性克隆后，抽提質粒進行Hind III和SalI雙酶切鑒定和RT-PCR檢測RNF6基因表達情況。圖2顯示重組質粒雙酶切后產生目的條帶和pcDNA-CHA載體部分條帶，證明人RNF6的cDNA序列已插入表達載體pcDNACHA中。RT-PCR檢測（圖3）顯示，與未轉染組及空載體組比較，陽性克隆穩定高表達RNF6 mRNA。

圖2 重組pcDNA-CHA-RNF6載體的雙酶切鑒定

圖3 轉染RNF6 后HepG2細胞IRS-2 mRNA表達的變化

2.3 Real time PCR、Western blot檢測 IRS-2的表達情況

試驗結果如圖4所示，攜帶RNF6的重組質粒轉染48 h后HepG2細胞中IRS-2的mRNA表達明顯下降（P<0.01），為對照組的37%。蛋白表達情況如圖5所示，在RNF6轉染細胞中，IRS-2蛋白表達顯著減少（P<0.01），空白對照與空載質粒IRS-2表達不變。

圖4 轉染RNF6 后HepG2細胞IRS-2 mRNA表達的變化

圖5 Western blot檢測IRS-2表達

3 討論

RNF6 是泛素-蛋白酶體系統中的一種E3連接酶，基因序列全長2 058 bp，能編碼685個氨基酸，包括C-端的RING-H2指結構和N端的螺旋結構域。研究表明［9］，RNF6通過C-端的RING-H2指結構誘發腎上腺受體（AR）的非水解泛素化而穩定AR，進而招募ARA54上調AR介導的基因轉錄活性。在糖尿病、胰島素抵抗時，肝臟、胰腺、肌肉和脂肪組織均出現異常的信號轉導［10］。有研究表明［11-13］，胞內蛋白降解除溶酶體途徑外，還有細胞凋亡過程中的caspases 途徑，以及降解大部分短周期壽命蛋白的泛素-蛋白酶體系統；選擇性降解某種蛋白能夠調節細胞增殖與分化、基因轉錄、細胞周期調控、抗原呈遞及信號轉導等各種生命過程；胰島素信號相關蛋白的異常降解在糖尿病發病機理中發揮至關重要的作用。

本試驗從cDNA 文庫中擴增出人RNF6基因的全長序列，并將其構建到pcDNA3.1-CHA 真核表達載體中，重組質粒轉染到HepG2細胞中，實時定量PCR檢測到IRS-2基因的mRNA水平明顯降低。有研究表明，機體內胰島素高濃度或長期高水平表達，可通過胰島素生長因子-1受體活化絲氨酸激酶，磷酸化Ser/Thr，進而抑制酪氨酸激酶活性磷酸化Tyr［14］。Pederson等［15］研究證實，Ser/Thr磷酸化后的IRS-1，空間構象改變易與泛素共價結合，進而被蛋白酶體降解。本研究結果顯示，泛素連接酶RNF6

下調靶蛋白IRS-2表達水平，但是否確實由于泛素化作用引起IRS-2基因表達下調，有待進一步驗證。由于泛素化下調的IRS-2可能導致胰島素信號通路障礙，是導致Ⅱ型糖尿病發生的分子機制，泛素化相關信號蛋白將是研究糖尿病治療藥物的新靶點。

4 結論

本研究以人cDNA為模板，成功構建RNF6基因全長編碼序列真核表達載體，重組質粒pcDNA3.1-CHA-RNF6轉染HepG2肝癌細胞株48 h后，使HepG2細胞IRS-2表達顯著下調，這一過程可能會由于RNF-6的泛素化作用導致胰島素信號通路障礙。

［1］ Yen SL, Chiu TY, Lin YC, et al. Obesity and hepatitis B infection are associated with increased risk of metabolic syndrome in university freshmen［J］. Int J Obes（Lond）, 2008, 32（3）：474.

［2］ Pagliassotti MJ, Kang J, Thresher JS, et al. Elevated basal PI 3-kinase activity and reduced insulin signalling in sucrose-induced hepatic insulin resistance［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2002, 282（1）：170-176.

［3］ Myer MG Jr, Sun XJ, White MF. The IRS-1 signaling system［J］. Trends Biochem Sci, 1994, 19（7）：289-293.

［4］ Wiedmann M, Tamaki S, Silberman R, et al. Constitutive overexpression of the insulin receptor substrate-1 causes functional upregulation of Fas receptor［J］. J Hepatol, 2003, 38（6）：803-810.

［5］ Kim SJ, DeStefano MA, Oh WJ, et al. mTOR complex 2 regulates proper turnover of insulin receptor substrate-1 via the ubiquitin ligase subunit Fbw8［J］. Molecular Cell, 2012, 48：875-887.

［6］ Banker GA, Cowan WM. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture［J］. Brain Res, 1977, 126：397-425.

［7］ Banker GA, Cowan WM. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture［J］. J Comp Neurol, 1979, 187：469-493.

［8］ Zhu L, Tong G, Chen J, et al. Cloning and identification of a novel RNF6 transcriptional splice variant Spg2 in human development［J］. Science in China（Life Sciences）, 2008, 51（4）：302-307.

［9］ Xu K, Shimelis H, Linn DE, et al. Regulation of androgen receptor transcriptional activity and specificity by RNF6-induced ubiquitination［J］. Cancer Cell, 15（4）：270-282.

［10］ Rome S, Meugnier E, Vidal H. The ubiquitin-proteasome pathway is a new partner for the control of insulin signaling［J］. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2004, 7（3）：249- 254.

［11］ Glickman MH, Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway：destruction for the sake of construction［J］. Physiol Rev, 2002, 82（2）：373- 428.

［12］ Kornitzer D, Ciechanover A. Modes of regulation of ubiquitin mediated protein degradation［J］. J Cell Physiol, 2000, 182（1）：1-11.

［13］ Groll M, Huber R. Substrate access and processing by the 20S proteasome core particle［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2003, 35（5）：606- 616.

［14］ Rhodes CJ. Type 2 diabetes a matter of beta cell life and death［J］. Science, 2005, 307（5）：380-384.

［15］ Pederson TM, Kramer DL, Rondinone CM. Serine/threonine phosphorylation of IRS-1triggers its degradation：possible regulation by tyrosine phosphorylation［J］. Diabetes, 2001, 50（1）：24-31.

（責任編輯 李楠）

Effect of Gene Ring Finger Protein 6 on the Expression of Insulin Receptor Substrate-2 in Hepatoma Cells

Gong Jian Song Jian
（Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Zibo Vocational Institute，Zibo 255314）

It was to construct an eukaryotic expression vector of ring finger protein 6（RNF6）gene and investigate the effect of RNF6 on the expression of insulin receptor substrate-2（IRS-2）. The coding sequence of hRNF6 gene was amplified by PCR with human cDNA as template. The pcDNA3.1-CHA-RNF6 was constructed and transfected into hepatocarcinoma cells（HepG2）by routine mole cular biology technology. The total RNA was extracted from HepG2 cells 72 hours post-transfection, the expression levels of IRS-2 was detected by real-time quantitative PCR. Western blotting was applied to detect the protein levels of IRS-2. Result showed that the mRNA level of IRS-2 gene in transfected HepG2 was 37% of the control. The expression level of IRS-2 was lower than the control group significantly（P<0.01）. The expression of IRS-2 was down-regulated in HepG2 significantly, and the disorder in insulin signal transduction pathway, which may result from enhanced ubiquitylation level of IRS-2.

Insulin receptor substrate-2 Ubiquitin RNF6 Insulin

2013-12-25

鞏健，女，副教授，研究方向：生物技術應用；E-mail：ghfh2008@126.com