溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶護(hù)航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息學(xué)分析

龐歡瑛周澤軍丁燏黃郁蔥吳灶和簡紀(jì)常

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶護(hù)航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息學(xué)分析

龐歡瑛1，2，3周澤軍1，2，3丁燏1，2，3黃郁蔥1，2，3吳灶和2，3，4簡紀(jì)常1，2，3

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）ZJ03株Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）分子伴侶護(hù)航蛋白（Chaperone escort protein）vscO基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，vscO基因全長462 bp，編碼153個(gè)氨基酸，理論分子量約為18.43 kD，pI值為9.22。細(xì)胞定位分析顯示vscO基因位于外周質(zhì)，不存在信號(hào)肽，無跨膜區(qū)。vscO基因具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)-35區(qū)和-10區(qū)，以及翻譯識(shí)別信號(hào)SD序列（Shine-Dalgarno sequence）。該氨基酸序列含有多種活性位點(diǎn)，如蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)等。系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌的VscO蛋白與副溶血弧菌聚為同一亞族。VscO亞基三維結(jié)構(gòu)模型顯示其與副溶血弧菌T3SS 的YscO蛋白有相似構(gòu)型。信號(hào)通路分析推測VscO位于T3SS的針狀樣結(jié)構(gòu)上。蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖譜發(fā)現(xiàn)VscO與10種T3SS蛋白具有相鄰關(guān)系。本研究結(jié)果將為溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)護(hù)航機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS） 分子伴侶護(hù)航 vscO基因

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一種嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于海水中，是水生動(dòng)物弧菌病的主要病原菌之一，能引起魚、蝦、貝等多種水產(chǎn)動(dòng)物爆發(fā)大規(guī)模弧菌傳染病［1-3］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。此外，該菌可導(dǎo)致人類的多種疾病，如腹瀉、中耳炎以及敗血癥等［4，5］，嚴(yán)重危害人類健康。

III型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system，T3SS）是細(xì)菌保守存在的“針狀樣”毒力裝置，與細(xì)菌的致病機(jī)制密切相關(guān)［6，7］，是病原菌研究的熱點(diǎn)之一。該裝置通過輸出通路（Export pathway）將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡［8，9］。研究發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌的T3SS輸出通路中存在分子伴侶護(hù)航機(jī)制（Chaperone escort mechanism），即護(hù)航蛋白和分子伴侶蛋白將效應(yīng)蛋白護(hù)送至胞外的機(jī)制，該機(jī)制在T3SS致病過程中起重要作用［10］。

本研究選取溶藻弧菌T3SS中分子伴侶護(hù)航蛋白VscO進(jìn)行研究，對其進(jìn)行基因克隆測序，并對其序列特征、信號(hào)通路、三維結(jié)構(gòu)、蛋白網(wǎng)絡(luò)互作等進(jìn)行具體分析，以期為溶藻弧菌T3SS護(hù)航機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 溶藻弧菌強(qiáng)毒株ZJ03，由本試驗(yàn)室從廣東省湛江港海域患病紅笛鯛魚體中分離并保存［11］；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購自天根公司；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純；引物合成和DNA測序均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。抗生素濃度為氨芐西林（Ap）100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌ZJ03總DNA的提取 將溶藻弧菌接種于TSB（2% NaCl）培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)18 h。取1 mL菌液于離心管中，10 000 r/min離心5 min收集菌體，參照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2vscO基因的克隆 根據(jù)GenBank登錄的溶藻弧菌全基因序列（Accession：NZ_AAPS00000000）設(shè)計(jì)一對引物。上游引物VscO1為：ATGATAGAACGTTTATTAGA，下游引物VscO2為：TTAGATAATGTCGACAGTG。以溶藻弧菌ZJ03總DNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后用DNA膠回收試劑盒切膠回收。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的測序 按照說明書操作步驟，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含IPTG/X-Gal的Ap＋/LB平板上進(jìn)行篩選，挑取陽性克隆送上海生工測序。

1.2.4 溶藻弧菌ZJ03 VscO生物信息學(xué)分析 采用NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列同源性比對和相似性分析；使用DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源比對分析；運(yùn)用ExPASy Proteomics Server（http：//ca.expasy.org）推導(dǎo)氨基酸序列、確定開放閱讀框（ORF）、分子量計(jì)算值（Mw）和理論等電點(diǎn)（pI）預(yù)測等；通過SignalP 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測信號(hào)肽序列；應(yīng)用TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；SoftBerry-Psite（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml? Topic = psite&group= programs & subgroup = proloc）預(yù)測氨基酸序列中的功能位點(diǎn)分布；使用Promoter 2.0軟件分析啟動(dòng)子。PSORT II Prediction（http：//psort.hgc. jp/ form2.html）預(yù)測亞細(xì)胞定位。使用Clastal 2.0及MEGA 5.0軟件，以鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用SWISS-MODEL（http：//www. swissmodel. expasy.org/）程序進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建［12］。Kegg軟件分析涉及的通路（http：//www.genome. jp/kegg/）［13］。STRING數(shù)據(jù)庫搜索蛋白網(wǎng)絡(luò)互作（http：//string.embl.de/）［14］。

2 結(jié)果

2.1vscO基因的全長克隆

PCR擴(kuò)增得到一條約500 bp的特異條帶（圖1-A），將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，菌落PCR擴(kuò)增出約500 bp的條帶（圖1-B）。測序表明，vscO基因的開放閱讀框（ORF）為462 bp，編

碼153個(gè)氨基酸（圖2），在GenBank上的登錄號(hào)為KJ179947。

圖1 vscO基因的克隆（A）和菌落PCR（B）

2.2 VscO的理化性質(zhì)

利用ExPASy軟件對溶藻弧菌ZJ03 VscO蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其原子總數(shù)為2 631，分子結(jié)構(gòu)式為C799H1334N248O249S1。理論分子量為18.430 kD，理論pI值為9.22。不穩(wěn)定系數(shù)66.17，脂肪系數(shù)為81.05，總平均親水性為-1.184，蛋白總體親水性較高。該蛋白不含有甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和半胱氨酸（Cys），在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為9，970（mol·cm-1）。酸性氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)為32個(gè)，堿性氨基酸（Arg + Lys）總數(shù)為36個(gè)，N末端是甲硫氨酸（Met）。在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中體外培養(yǎng)表達(dá)的半衰期為30 h。

2.3 VscO的序列分析

應(yīng)用Blast程序搜索發(fā)現(xiàn)，vscO基因在染色體上的相對排列順序如圖3所示，箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。根據(jù)其他細(xì)菌的研究結(jié)果推測SycN是VopN的分子伴侶，TyeA是調(diào)節(jié)蛋白，VopN是T3SS的效應(yīng)蛋白，VscN是T3SS中ATP酶，VscP是控制T3SS針筒長度的“尺子”，VscQ可以形成T3SS的內(nèi)膜基座［15，16］。

利用SignalP 4.0 Server程序?qū)scO氨基酸序列進(jìn)行N端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其無明顯的信號(hào)肽切割位點(diǎn)，不存在信號(hào)肽。TMHMM Server 2.0程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜區(qū)。SoftBerry-Psite程序預(yù)測發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列含有2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（71-73 aa，93-95 aa），1個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)（40-43 aa），1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（132-138 aa），1個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶信號(hào)位點(diǎn)（139-142 aa），1個(gè)微體C末端靶信號(hào)位點(diǎn)（57-59 aa）（圖2）。Promoter 2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)vscO基因有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)-35區(qū)和-10區(qū)，以及翻譯識(shí)別信號(hào)SD序列（Shine-Dalgarno sequence）（圖2）。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，VscO位于細(xì)胞核中可能性最大，為56.5%，其次為線粒體，可能性為21.7%，而位于線粒體和細(xì)胞支架的可能性分別為17.4%和4.3%。

圖2 vscO基因核苷酸及其編碼的氨基酸序列

圖3 vscO基因在染色體相對排列順序

2.4 VscO的同源性及進(jìn)化分析

BLAST分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌VscO與其他弧菌的VscO具有較高的同源性，其中與副溶血弧菌的VscO氨基酸序列的同源性最高達(dá)86%，與塔斯曼弧菌（Vibrio tasmaniensis）的同源性為72%，與塔式弧菌（Vibrio tubiashii）的同源性為71%，與Vibrio caribbenthicus的同源性為70%，與Vibrio azureus的

同源性最低為65%。氨基酸序列同源性比較（圖4）表明VscO在弧菌中是相對保守的。利用Neighborjoining法，將推導(dǎo)的VscO氨基酸序列與其他微生物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌的VscO蛋白可明顯地與副溶血弧菌聚為同一亞族，表明它們之間有較近親緣關(guān)系，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化特征分類結(jié)果一致。

圖4 vscO基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種同源性比較

圖5 VscO系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 VscO的三維結(jié)構(gòu)

將VscO氨基酸序列提交至SWISS-MODEL 程序，自動(dòng)搜索同源蛋白作模板，得到VscO單亞基三級結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果見圖6-A，與其同源蛋白副溶血弧菌 YscO非常相似（圖 6-B），都具有兩個(gè)α-螺旋，不存在β-折疊，在兩個(gè)α-螺旋之間含有一個(gè)轉(zhuǎn)角。兩者的差別是YscO的第一個(gè)α-螺旋的長度比VscO略長。

2.6 VscO的信號(hào)通路分析

采用Kegg 軟件對VscO的信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測分析，以細(xì)菌T3SS的信號(hào)通路為模板繪制溶藻弧菌VscO信號(hào)通路，見圖7。由圖推測VscO位于Ⅲ型分泌系統(tǒng)的“針狀樣”結(jié)構(gòu)上與VscP和VscX相鄰。

2.7 VscO蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作分析

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫搜索VscO與其他T3SS蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作，結(jié)果見圖8。目前已知vscO與vopD、vscP、vopB、vscS、vscN、vscT具有同時(shí)生成

（cooccurrence）、相鄰（neighborhood）的關(guān)系，其他關(guān)系還有待研究（textmining），而與vscQ、vscR、vscX僅有相鄰的關(guān)系，它們的其他關(guān)系還有待挖掘，下一步將對這些基因進(jìn)行克隆和序列分析，初步了解它們的功能。

圖6 溶藻弧菌ZJ03 VscO（A）與副溶血弧菌 YscO（B）三維結(jié)構(gòu)比較

圖7 VscO蛋白的信號(hào)通路圖

圖8 VscO蛋白與其他T3SS蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作圖

3 討論

Ⅲ型分泌系統(tǒng)是溶藻弧菌重要的毒力因子之一，與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)。病原菌黏附到宿主細(xì)胞表面后，通過T3SS直接將特異性效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞內(nèi)，改變宿主的各種生理功能，破壞宿主的組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到能在宿主體內(nèi)生存和繁殖的目的［17］。

T3SS分子伴侶護(hù)航蛋白是最近鑒定的一種T3SS功能蛋白，其作用一方面是護(hù)航分子伴侶到相應(yīng)的位置，使分子伴侶以正確的方式與效應(yīng)蛋白結(jié)合；另一方面，在護(hù)航結(jié)束后，重新將分子伴侶釋放出來以便下一輪的循環(huán)，從而保證分子伴侶的重復(fù)利用和效應(yīng)蛋白的輸出效率［18］。分子伴侶護(hù)航蛋白與分子伴侶結(jié)合，作用是穩(wěn)定分子伴侶性質(zhì)和重復(fù)利用分子伴侶［19］。

目前，對T3SS分子伴侶蛋白的研究不多，只報(bào)道了少數(shù)幾種。例如：耶爾森氏菌的SycD［20］，福氏志賀氏菌的IpgC［21］和Spa13［22］，鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的FliJ和InvI，耶爾森菌的YscO均為此類蛋白［10］。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）的YscO是分子伴侶SycD的護(hù)航蛋白，其功能是護(hù)航SycD分子伴侶，幫助轉(zhuǎn)位子蛋白YopB和YopD參與到宿主細(xì)胞膜上T3SS針孔的形成［23］。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的FliJ，它是鞭毛分子伴侶護(hù)航蛋白，功能是將空載的分子伴侶轉(zhuǎn)運(yùn)給小纖維絲帽類亞基和鞭毛鉤，使得鞭毛順利組裝［18］。InvI也是鼠傷寒沙門氏菌中分子伴侶SicA的護(hù)航蛋白。經(jīng)過InvI的護(hù)航，分子伴侶SicA幫助其效應(yīng)蛋白SipC通過T3SS的分泌，參與到宿主細(xì)胞膜上T3SS針孔的形成［10］。

目前，雖然溶藻弧菌T3SS護(hù)航蛋白已有少量研

究，但主要集中在其免疫功能上［24］，有關(guān)其詳細(xì)的生物信息學(xué)研究仍鮮見報(bào)道。本研究對T3SS系統(tǒng)中分子伴侶護(hù)航蛋白VscO進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，vscO基因全長462 bp，編碼153個(gè)氨基酸，理論分子量為18.43 kD，理論pI值為9.22。BLAST分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌VscO與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）VscO氨基酸序列的同源性最高達(dá)86%。信號(hào)通路分析推測VscO位于T3SS的“針狀樣”結(jié)構(gòu)上，推測其主要功能是是分子伴侶的護(hù)航蛋白，但是其與分子伴侶的互作區(qū)域目前尚未清楚。我們下一步將對VscO進(jìn)行基因敲除，然后對野生株和缺失株的生理生化特性進(jìn)行分析，再應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析缺失株和野生株的胞外分泌蛋白，從中篩選VscO相關(guān)的分子伴侶和效應(yīng)蛋白，并明確VscO與分子伴侶的互作區(qū)域，為闡明T3SS的護(hù)航機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從溶藻弧菌ZJ03成功克隆T3SS系統(tǒng)中分子伴侶護(hù)航蛋白VscO的全基因序列。該基因全長462 bp，編碼153個(gè)氨基酸，理論分子量為18.43 kD，理論pI值為9.22。VscO位于外周質(zhì)，無信號(hào)肽和跨膜區(qū)。該氨基酸序列含有2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶信號(hào)位點(diǎn)，1個(gè)微體C末端靶信號(hào)位點(diǎn)。vscO基因具-35和-10轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以及翻譯識(shí)別信號(hào)SD序列（Shine-Dalgarno sequence）。同源性分析表明與副溶血弧菌親緣關(guān)系較近。亞基三維結(jié)構(gòu)模型顯示其與副溶血弧菌YscO蛋白有相似構(gòu)型。信號(hào)通路分析推測其位于T3SS的針狀樣結(jié)構(gòu)上。蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖譜表明VscO與10種T3SS蛋白具有相鄰關(guān)系。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of T3SS Chaperone Escort Protein VscO from Vibrio alginolyticus

Pang Huanying1，2，3Zhou Zejun1，2，3Ding Yu1，2，3Huan Yucong1，2，3Wu Zaohe2，3，4Jian Jichang1，2，3
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Primers for PCR cloning were designed according to the whole genome sequence of Vibrio alginolyticus published in GenBank. The type III secretion system（T3SS）chaperone escort protein vscO gene of V.alginolyticus strain ZJ03 was amplified by PCR and cloned into pMD18-T vector. Sequence analysis revealed that vscO gene is 462 bp and encodes a putative protein of 153 amino acids. The predicted molecular weight（MW）of VscO was 18.43 kD with an estimated pI of 9.22. Using SignalP 4.0 and TMHMM Server 2.0 software, it was predicted that the VscO protein was located in periplasm. It did not contain a signal peptide or a transmembranous region. The vscO gene with transcription initiation region at -35 and -10 region, and a translation recognition signal sequence（SD Shine-Dalgarno sequence）. This protein had some active sites, such as phosphorylation sites. To further analyze the evolutionary relationship among VscO, a molecular phylogenetic tree was constructed using Mega 5.0 software. In this tree, the VscO protein showed high genetic relationship with Vibrio parahaemolyticus. The three-dimensional structure of VscO was determined using SWISS-MODEL work-space and it had a similar structure with YscO protein of V. parahaemolyticus. Signaling pathway analysis showed that VscO is located at the “needle” site of T3SS. Protein interaction map network found that the relation between VscO and 10 kinds of T3SS proteins was neighbourhood. These results can provide a basis for further studies on the chaperone escort machanism used by T3SS export pathway of Vibrio species.

Vibrio alginolyticus T3SS Chaperone escort vscO gene

2014-04-16

國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD17B02），廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013040014562）

龐歡瑛，女，博士，講師，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害；E-mail：phying1218@163.com

簡紀(jì)常，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com