滑桃樹種子化學組分對其內生菌影響的研究

吳欣

（國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005）

滑桃樹種子化學組分對其內生菌影響的研究

吳欣

（國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005）

Streptomyces sp. WXC菌株是從滑桃樹（Trewia nudiflora L.）種子中分離到的一株內生菌。提取植物種子的化學成分，對其進行溶劑分組，檢測各組分對內生放線菌S. sp. WXC的生長、代謝和活性化合物的影響，結果表明，滑桃樹種子水溶性提取物Water ext.對S. sp. WXC的生長、次生代謝產物和活性化合物都有明顯的促進作用。

滑桃樹種子化學組分 Streptomyces sp. WXC菌株 活性化合物 化學防御

在生物間的各種相互作用中，生物的化學防御（共生化學防御）是特別有趣的，因為它既是保持生物物種分布平衡的基本因素，也是促進生物協同進化的重要因素。共生通過水平基因轉移來影響基因庫，并且對次生代謝的進化施加影響；更重要的是，共生微生物產生次生代謝產物可能是共生微生物影響其宿主的一種重要適應機制［1］。過去研究較多的是植物和土壤微生物的化學防御，例如，植物與固氮菌Frankia的相互關系［2］，而植物與其內生放線菌的化學防御［3］，尤其是與鏈霉菌的化學防御研究得較少［4，5］。滑桃樹（Trewia nudifloraL.）是大戟科滑桃樹屬植物，熱帶大喬木，該植物的主要化學成分為具有抗腫瘤活性的美登木素類化合物［6-8］。Streptomycessp. WXC（S. sp. WXC）菌株是從滑桃樹種子中分離到的一株內生鏈霉菌。前期試驗發現，

S. sp. WXC菌株在常見的培養基上生長緩慢，菌株生物量低，當培養基中加入滑桃樹種子提取物后，菌株生長良好，生物量明顯增加，菌株發酵產物的抗菌活性也隨之提高。因此，我們推測很可能是植物種子中的化學成分誘導S.sp. WXC菌株提高了生物量和活性化合物的產量。本研究提取植物種子的化學成分，對其進行溶劑分組，檢測各組分對內生放線菌S. sp. WXC的生長、代謝和活性化合物的影響，旨在探究滑桃樹種子化學成分對其內生菌S.sp. WXC菌株的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

滑桃樹（T. nudifloraL.）種子由云南西雙版納植物園提供。

分析純級石油醚、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇，色譜級甲醇，無水Na2SO4均購于英杰生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 滑桃樹內生菌S. sp. WXC菌株的分離和保藏S. sp. WXC菌株是由滑桃樹無菌苗中分離到的一株內生菌。用含有赤霉素（1 mg/mL）的瓊脂培養基誘導滑桃樹無菌苗，當其生長到5-6 cm時，將其切成5 mm的片段，置于高氏一號培養基上，28℃培養分離得到WXC菌株。該菌株的形態特征和GenBank序列比對結果表明，該菌株屬于鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。菌株置于10%甘油中，密封于安培管中，-70℃保藏。

1.2.2 滑桃樹種子化學組分的提取 將滑桃樹種子去殼，稱重得100 g，研磨成細小的碎塊，用石油醚浸泡，在50℃水浴中加熱大約2 h，待冷卻后過濾，共提取3次，獲得石油醚提取液，減壓回收溶劑，獲得石油醚提取物1（PE ext.1）。將石油醚加熱回流提取過濾后獲得的種子殘渣用乙酸乙酯加熱回流提取并過濾，方法同前，提取3次，獲得乙酸乙酯提取液，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物。用石油醚∶甲醇＝1∶1對乙酸乙酯提取物進行萃取，獲得甲醇提取物1（MeOH ext.1）和石油醚提取物2（PE ext.2），將PE ext.1和PE ext.2合并得到石油醚提取物（PE ext.）。將經過石油醚和乙酸乙酯加熱回流提取后的種子殘渣用80%的甲醇進行加熱回流提取，重復3次，獲得稀甲醇提取液，減壓回收溶劑，得到甲醛提取物2（MeOH ext.2）。將MeOH ext.1和MeOH ext.2合并，減壓回收溶劑，并用乙酸乙酯∶水＝1∶1萃取3次，得到乙酸乙酯萃取液和水相。在乙酸乙酯萃取液中加入過飽和的無水Na2SO4，靜置、過濾后，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物（EA ext.）。水相部分用等體積正丁醇萃取3次，獲得正丁醇萃取液和水相，分別減壓回收溶劑，得到正丁醇提取物（Bu ext.）和水溶液提取物（Water ext.）。將PE ext.、EA ext.、Bu ext.和Water ext.定容至250 mL溶液中，每組分濃度相當于400 mg/mL滑桃樹種子的濃度。

1.2.3 滑桃樹種子化學組分對S.sp. WXC菌株生長狀態的影響 蘸取S.sp. WXC菌株的孢子于10 mL無菌水中，制成菌懸液，將菌懸液涂布于高氏一號培養基上，用微量注射器分別吸取25 μL的化學組分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.）于紙片上，待紙片吹干后，平鋪于培養基上，并用空白的紙片作對照（blank control），將平板置于28℃培養10 d，觀察菌株生長狀態。

1.2.4 滑桃樹種子化學組分對S. sp. WXC菌株生物量的影響 在100 mL高氏一號培養基中分別加入250 μL滑桃樹種子化學組分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.），將S.sp. WXC菌株接種在添加了滑桃樹種子化學組分的高氏一號培養基和未添加任何化學組分的高氏一號培養基中分別進行培養，在28℃，180 r/min的條件下，分別培養3、4、5和6 d。根據不同培養時間收菌，4℃，6 000 r/min，15-20 min，菌體經過冷凍抽干后，稱菌體干重。以上每個樣品分別作3個重復。

1.2.5 不同濃度的滑桃樹種子化學組分與S. sp. WXC菌液濃度的關系 將不同濃度的滑桃樹種子化學組分加入高氏一號培養基中（終濃度分別為0、1、5、25、125、250、500和1 000 μg/mL），將S.sp. WXC菌株接種到培養基中，于28℃，180 r/min，培養48 h。通過檢測菌體的OD600值判斷滑桃樹種子化學組分的濃度與菌液濃度的關系。以上每個樣品分別作3個重復。

1.2.6 滑桃樹種子化學組分對S.sp. WXC菌株次生代謝產物的影響 在100 mL高氏一號培養基中分別加入250 μL滑桃樹種子化學組分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.），將S.sp. WXC菌株接種在添加了滑桃樹種子化學組分的高氏一號培養基和未添加任何化學組分的高氏一號培養基中分別進行培養，在28℃，180 r/min的條件下，分別培養3、4、5和6 d。根據不同培養時間，收集菌體，4℃，6 000 r/min，15-20 min，上清用等體積乙酸乙酯萃取2遍，濃縮得到胞外的乙酸乙酯相；菌體經過冷凍抽干后，用乙酸乙酯提取得到胞內的乙酸乙酯相。以上每個樣品分別作3個重復。

1.2.7 滑桃樹種子化學組分對S.sp. WXC菌株活性化合物的影響 對胞內和胞外的乙酸乙酯相，分別用HPLC技術來檢測其中活性成分frenolicin B的含

量。以純品frenolicin B作為標準樣，分別取3、6、12、25和50 μg 上樣，洗脫劑為甲醇∶水（60∶40），洗脫條件為1 mL/min，27℃。根據所得的數據制作frenolicin B的標準曲線。將胞內和胞外的乙酸乙酯相分別經過HPLC檢測，洗脫劑為甲醇∶水（60∶40），洗脫條件為1 mL/min，27℃。根據標準曲線，算出各樣品中frenolicin B的含量，frenolicin B的產量與S.sp. WXC菌株的生物量的比值，即為frenolicin B的相對表達量。

2 結果

2.1 滑桃樹種子化學組分對S. sp. WXC菌株生長和生物量的影響

本研究在前期試驗現象基礎上，提取了滑桃樹種子的化學成分，根據成分的化學極性，對其進行溶劑分組，排除組分PE ext.（主要為常見的脂溶性化學成分），通過紙片法研究滑桃樹種子化學組分（Water ext.、EA ext.和Bu ext.）對S.sp. WXC菌株生長狀態的影響。結果（圖1）表明，位于Water ext.紙片周圍的菌株生長較多且緊密，其次為Bu ext.，EA ext.對菌株生長并沒有明顯的作用，說明滑桃樹種子中的水溶性物質對S.sp. WXC菌株的生長起到明顯的促進作用。

圖1 滑桃樹種子化學組分對S. sp. WXC菌株生長狀態的影響

除此以外，與不加種子化學成分的培養條件相比，S.sp. WXC菌株在添加種子化學成分后，菌株生物量發生了較大的變化，從3、4、5和6 d的數據來看，添加Water ext.的菌株干重幾乎是不添加時的3倍（圖2）。Bu ext.對菌株干重的影響次之，EA ext.對菌株干重并沒有明顯的作用。該結果進一步確定了滑桃樹種子的水溶性成分能刺激菌體生長。而且S.sp. WXC的菌液濃度隨著Water ext.濃度的提高而升高，當Water ext.濃度在1-25 μg/mL時，菌株WXC的菌液濃度急劇上升，但在125-1 000 μg/mL時，菌液濃度增加較為平緩（圖3）。

圖2 滑桃樹種子化學組分對S. sp. WXC菌株生物量的影響

圖3 不同濃度Water ext.對S. sp. WXC菌液濃度的影響

2.2 滑桃樹種子化學組分對S.sp. WXC菌株次生代謝產物的影響

從S.sp. WXC菌株胞內和胞外次生代謝產物的產量來看，滑桃樹種子的Water ext.對胞外的產物有明顯的促進作用，相比之下，Bu ext.和EA ext.對胞外的產物沒有明顯的作用。在第3天添加Water ext.的菌株胞外次生代謝產物的產量與不加種子成分的菌體產量一致，但在菌體的指數生長期，添加Water ext.的菌株胞外次生代謝產物的產量逐漸增加，到第6天產量幾乎是不添加種子成分的2-3倍（圖4）。可見，種子的水溶性提取物對S.sp. WXC菌株胞外的次生代謝產物有明顯的誘導作用，而對胞內的次生代謝產物無明顯作用。

圖4 滑桃樹種子Water ext.對S. sp. WXC菌株次生代謝產物的影響

2.3 滑桃樹種子化學組分對S.sp. WXC菌株活性化合物的影響

從3-6 d HPLC的檢測結果（圖5）表明，添加了Water ext.的fenolicin B的產量逐漸增加，而Bu ext.和EA ext.對fenolicin B的產量影響并不大。在第6天時，添加了Water ext.的fenolicin B的產量達到不添加Water ext.的3倍左右，說明滑桃樹種子的水溶性提取物誘導內生菌提高了活性化合物fenolicin B的產量。

圖5 滑桃樹種子化學組分對fenolicin B產量的影響

3 討論

S.sp. WXC菌株是從滑桃樹種子中分離到的一株內生菌，在長期與宿主植物相互作用的過程中，S.sp. WXC菌株已經適應了植物的內生小環境，當將它從植物中分離出來，并培養在人工培養基上時，其生長速度緩慢。大部分不可培養或難以培養的內生菌也出現同樣的現象，較為典型的如菌株Frankia，在人工培養時，與大多數自由生長的細菌相比，該菌的生長非常緩慢，并且呈現出各種不同的形態［9］。本研究發現，滑桃樹的種子水溶性提取物Water ext.對S.sp. WXC菌株的生長有明顯的促進作用，并且菌株的生物量隨著Water ext.濃度的升高而提高。Water ext.對S.sp. WXC菌株的次生代謝產物也有明顯的促進作用，誘導菌株提高了主要活性化合物fenolicin B的產量。滑桃樹種子的化學組分Water ext.、Bu ext.和EA ext.的分子極性由大到小，各組分對S.sp. WXC菌株的影響程度中Water ext.最明顯，EA ext.對菌株的影響不明顯，說明對S.sp. WXC菌株有誘導作用的植物成分是分子極性比較大的物質，很可能是水溶性的成分。本試驗為進一步研究對其內生菌S.sp. WXC有影響的滑桃樹種子化學成分奠定了基礎。

滑桃樹水溶性化學組分對S.sp. WXC菌株的活性化合物fenolicin B的影響，說明了S.sp. WXC菌株作為滑桃樹的內生菌，在與植物宿主的長期協同進化過程中，通過產生具有抑制真菌活性的物質，形成了共生化學防御，并且這種活性物質可以被植物宿主所誘導。植物與土壤微生物的化學防御機制主要應用于生物防治。由于植物內生菌分布于植物的不同組織中，有充足的營養物質，同時受到植物組織的保護，不受外部惡劣環境如強烈日光、紫外線、風雨等的影響，具有穩定的生態環境。因此，相對于附生菌內生菌更易于發揮生防作用［10］。而且植物內生菌可以直接面對病菌的侵染，通過降解病菌菌絲、產生拮抗物質或誘導植物產生系統抗性抑制病原物，對病菌的致病因子或病菌本身發起攻擊，而植物本身的基因并未發生改變，仍然可以保持植物的天然性狀［11］。因此，植物內生放線菌是植物病害生物防治的天然資源菌，具有廣闊的理論研究價值和開發應用前景。

4 結論

主要研究滑桃樹種子不同化學組分對其內生菌Streptomycessp. WXC生長、代謝和活性化合物的影響。結果表明，滑桃樹種子水溶性提取物Water ext.對S. sp. WXC的生長、次生代謝產物甚至是活性化合物都有明顯的促進作用。

［1］ Maynard-Smith J. A Darwinian view of symbiosis. Symbiosis as a source of evolutionary innovation［M］. Margulis L, Fester R, eds. Speciation and Morphogenesis. Camibridge：MIT Press, 1991：26-39.

［2］ Benson DR, Silvester WB. Biology of Frankia strains, actinomycete symbionts of actinorhizal plants［J］. Microbiology Review, 1993, 57（2）：293-319.

［3］ Schrey SD, Tarkka MT. Friends and foes：streptomycetes as modulators of plant disease and symbiosis［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 2008, 94（1）：11-19.

［4］ Conn VM, Walker AR, Franco CMM. Endophytic actinobacteria induce defense pathways inArabidopsis thaliana［J］. Molecular Plant Microbe Interaction, 2008, 21（2）：208-218.

［5］ Coombs JT, Franco CMM. Isolation and identification of actinobacteria isolated from surface-sterilized wheat roots［J］. Applied Environment Microbiology, 2003, 69（9）：5603-5608.

［6］ Powell RG, Weisleder D, Smith CR. Novel maytansinoid tumor inhibitors fromTrewia nudiflora：trewiasine, dehydrotrewiasine and demethyltrewiasine［J］. Journal Organic Chemistry, 1981, 46（22）：4398-4403.

［7］ Powell RG, Weisleder D, Smith CR, et al. Treflorine, Trenudine, and N-Methyltrenudone：novel maytansinoid tumor inhibitors containing two fused macrocyclic rings［J］. Journal of the American Chemical Society, 1982, 104（18）：4929-4934.

［8］ Powell RG, Smith CR, Plattner RD, et al. Additional new maytansinoids fromTrewia nudiflora：10-epiterwiasine and nortrewiasine［J］. Journal of Natural Proctors, 1983, 46（5）：660-666.

［9］ Benson DR, Silvester WB. Biology of Frankia strains, actinomycete symbionts of actinorhizal plants［J］. Microbiol Rev, 1993, 57（2）：293-319.

［10］ Andrews JH. Biological control in the phyllosphere［J］. Annual Review Phytopathology, 1992, 30：603-635.

［11］ Shudo E, Iwasa Y. Inducible defense against pathogens and parasites：optimal choice among multiple options［J］. J Theor Biol, 2001, 209（2）：233-247.

（責任編輯 馬鑫）

The Research on the Influence of Trewia nudiflora Seed Chemical Components on Its Endophyte

Wu Xin
（Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration，Xiamen 361005）

Streptomyces sp. WXC was an endophytic strain isolated from the seed of Trewia nudiflora. Trewia nudiflora seed chemical components were extracted and classified. The results showed that the production of frenolicin B was induced by the addition of the Water ext., which was correlated to the upregulation of growth and secondary metabolites. Therefore, we speculated that the inducible production of the antifungal frenolicin B may be an important adaptation mechanism allowing the symbiont, S. sp. WXC, to affect its host, T. nudiflora, through the function of symbiotic chemical defense.

Trewia nudiflora seed chemical components Streptomyces sp. WXC Active compound Chemical defence

2013-12-03

吳欣，女，博士，工程師，研究方向：微生物學；E-mail：careless78@gmail.com