質譜非標記定量分析小麥抗條銹病近等基因系蛋白質變化

黃宇馮晶饒力群徐世昌潘映紅

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；2.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081；3.國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京 100081；4.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193）

質譜非標記定量分析小麥抗條銹病近等基因系蛋白質變化

黃宇1，2，3馮晶4饒力群1徐世昌4潘映紅2，3

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；2.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081；3.國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京 100081；4.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193）

利用基于液相色譜串聯Orbitrap質譜（Q Exactive）的非標定量（Label-free）技術，對小麥抗病單基因近等基因系Taichung29*6/Yr10和背景品種Taichung29葉片的蛋白質表達進行了比較分析。經MASCOT軟件搜庫，在兩個樣品中共同鑒定到2 257個蛋白，其中有準確定量信息的蛋白共1 549個，含量變化大于2倍的差異蛋白有102個。對102個差異表達蛋白進行了Gene Ontology（GO）功能注釋和分析，發現他們多數定位于細胞基質和核糖體等細胞器，具備結合、催化等功能，主要參與代謝、細胞過程、應激等生物學進程，其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶體-β-葡萄糖苷酶和鐵蛋白等可能與小麥抗病單基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10的抗病性有一定相關性。

小麥 條銹病 抗病性 蛋白質組學 非標記定量 Q Exactive質譜

小麥條銹病是由小麥條銹病菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）引起的小麥葉部病害，嚴重時也危害穗部。小麥條銹病在許多國家和地區均有發生，我國是小麥條銹病發生最廣泛的國家之一［1，2］。防治小麥條銹病最有效、最經濟、最安全的方法是利用抗病品種。雖然國際上已經命名了49個位點的55個小麥抗條銹病基因（Yr1-Yr52），但其中大多數抗病基因具有生理?；?，常常因為條銹菌小種的快速變異而失去抗性，目前，只有少數的抗病基因仍保持抗性，如Yr5、Yr10和Yr15等［2-5］。隨著大

量物種基因組測序的完成，人們清楚的意識到單純從基因組和轉錄組的信息并不能完全揭示生命活動的規律，作為功能基因組學研究內容之一的蛋白質組學已經成為生命科學研究領域的熱點和前沿［6］。目前，已知的小麥抗條銹病基因都是通過遺傳推導確定的，僅有極少數基因如Yr36的序列已經明確。因此，從蛋白質組學的角度去揭示病原物致病機理和抗病品種的抗病機制，對小麥抗條銹性的合理利用和小麥條銹病的可持續控制極具研究價值。

雙向電泳是目前蛋白質組學研究的傳統方法［7-9］，但該技術本身存在分離蛋白范圍有限、歧視效應、與質譜聯用效果差等諸多缺陷［10］。近年來，隨著高精度生物質譜技術和基于生物信息學的海量數據處理技術的進步，規?；木_測量細胞內蛋白質組的表達變化已成現實。定量蛋白質組研究方法也從傳統的基于二維凝膠電泳結合質譜鑒定的策略向著更高準確度、更大范圍和更高通量的方向發展。蛋白質組學定量方法根據是否對蛋白質/多肽進行標記可以分為標記和非標記兩類。標記定量方法是基于在肽段中引入穩定同位素標記（如2H、13C、15N、18O），使得在同一次質譜掃描中標記“輕”和“重”同位素的多肽具有相同的色譜行為和離子化效率，此時成對出現的質譜峰信號的相對強度可以精確地反映樣品中蛋白質的比例。根據同位素摻入的方式，標記方法可以分為代謝標記、酶促標記和化學標記等，在這些標記方法中，化學標記的種類最為繁多，應用也最為廣泛。代表性的化學標記方法包括標記多肽（蛋白質）N端氨基的iTRAQ［11］、標記C端羧基的酯化標記、針對半胱氨酸巰基的ICAT［12］以及與質譜多反應監測（MRMMS）技術聯用的mTRAQ標記技術［13］等。以上這些標記定量方法具有良好的定量可靠性，不僅可以用于不同樣品間的相對定量分析，還可以用于蛋白質的絕對定量分析，但成本普遍偏高。相對于傳統的標記定量法，非標定量法（Label-free）不需要在樣本分析前對蛋白/多肽進行標記，避免了樣品處理過程中可能造成的損失，在檢測肽段的數量、蛋白質的覆蓋率和分析通量方面具有較大優勢，且不受樣品來源和數量限制。非標定量法通過比較質譜譜圖計數（spectrum counting）或質譜峰強度（peak area intensity）分析不同來源樣品蛋白的含量變化，是目前比較蛋白質組學上運用較為普遍的一種手段。Boeri等［14］采用Label-free方法和MALDI-Q-TOF 技術在定量分析表皮生長因子的磷酸化蛋白動力學、蛋白質覆蓋率、序列鑒定、識別磷酸化位點等方面取得了新進展。Wang等［15］采用非標定量方法分別結合LCQ、LTQ-FT質譜對多種樣品的重現性作了測試，并詳細研究分析了蛋白質的磷酸化過程。最近，Zhang等［16］借助LTQ質譜和PTMap軟件，鑒定出酵母菌組蛋白上新的丙?；投□；揎?，并發現了14種潛在的、未知的蛋白修飾。

本研究以非標定量法結合液相色譜串聯質譜技術對小麥感病品種Taichung29（T29）以及抗病近等基因系Taichung 29*6/Yr10（TYr10）進行差異蛋白分析，并通過生物信息學的方法分析差異蛋白所屬的細胞成分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物學途徑（Biological process），旨在為小麥條銹病的可持續控制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 小麥感病品種T29以及抗病品種近等基因系TYr10小麥均由中國農業科學院植物保護研究所條銹病組繁殖培養。

1.1.2 材料的培養 小麥種子經浸潤，催芽后種于口徑50 cm×100 cm塑料盆中，置于自控溫室中（溫度晝15-20℃/夜11-14℃，光照強度6 000 Lx，光照時間12 h），直到幼苗于溫室內培養至1葉期。

1.1.3 主要儀器和試劑 HPLC液相系統Easy-nLC 1000（美國Thermo Scientific公司）；Q Exactive MS質譜儀（美國Thermo Scientific公司）；Mini垂直蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；冷凍高速離心機（美國科峻儀器公司）；Lambda25型紫外可見分光光度計（美國 Perkin-Elmer 公司）；溴酚藍bromophenol blue、碘乙酰胺IAA、二硫基蘇糖醇DTT、聚丙烯酰胺Acr、過硫酸鈉APS、甘氨酸Glycine、四甲基乙二胺TEMED、十二烷基硫酸鈉SDS、三羥甲基氨基甲烷Tris（美國GE Healthcare公司）；測序級胰蛋白酶TPCK-Trypsin（美國Promega公司）；乙腈ACN、三

氟乙酸TFA（美國Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片總蛋白的提取 根據劉偉霞等［17］的方法稍加修改，稱取新鮮1葉期小麥葉片2 g，液氮研磨20 min，轉入50 mL離心管中，加入50 mL預冷丙酮（2% DTT，10% TCA）-20℃過夜沉淀（至少12 h）。離心40 000×g，1 h，棄去上清。加入50 mL冰丙酮（2% DTT）放入-20℃，靜置1 h（中間震蕩3次）40 000×g，1 h離心，重復3次，將沉淀至于通風廚吹干。沉淀即為蛋白粗樣品，若要長期儲存則放于-80℃冰箱保存，或將干粉溶于UA緩沖液中（尿素8 mol/L，Tris-HCl 100 mmol/L，pH8.5）用于電泳以及酶解。

1.2.2 蛋白定量 參照Bradford法進行蛋白定量［18］，采用BSA做標準曲線。

1.2.3 SDS-PAGE 1D SDS-PAGE參考儀器說明并在Mini-protean Ⅲ cell垂直板電泳儀上進行。

1.2.4 FASP酶解 取蛋白總量為1 mg的蛋白裂解樣品于10 k超濾管中，并加入DTT（20 mmol/L）還原3 h，加入200 μL UA緩沖液，離心14 000×g，15 min離心，重復兩次。加入100 μL IAA，600 r/min混勻1 min，暗處孵育20 min，14 000×g，10 min離心。加入200 μL UA，再離心15 min，重復兩次。加入200 μL ABC（碳酸氫銨0.05 mol/L），離心14 000×g，10 min離心，重復兩次。轉入新的收集管，加入一定量ABC，加入Trypsin（1∶50）；混勻，37℃搖床16-20 h離心14 000×g，10 min離心，加入40 μL 50 mmol/L ABC，離心14 000×g 10 min離心，凍干，-20℃保存。

1.2.5 色譜條件 高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000；色譜柱：Easy-spray column（C18，2 μm，100?，75 μm×15 cm）；流動相：A：0.1% Formic acid，2% Acetonitrile in water；B：0.1% Formic acid in Acetonitrile；梯度：3%-8% B in 10 min，8%-20% B in 78 min，20%-30% B in 15 min，30%-90% B in 10 min，90% B for 7 minutes；流速：250 nL/min。

1.2.6 質譜分析條件 質譜儀：Thermo Scientific Q Exactive；噴霧電壓：2.3 kV；毛細管溫度：250℃；S-lens：55%；碰撞能量：27% HCD；分辨率設置：一級70 000@m/z 200，二級17 500@m/z 200；母離子掃描范圍：m/z 300-1800；子離子掃描范圍：start from m/z 100；Data-dependent MS/MS：Top 15。

1.2.7 Q Exactive質譜數據分析 原始文件（raw file）使用Maxquant軟件進行Label-free定性和定量分析，搜索相應的小麥蛋白數據庫。具體搜庫參數如下：前體離子質量偏差：10 ppm；碎片離子質量偏差：25 mmu；固定修飾：半胱氨酸（Cysteine）烷基化（+57.021 Da）；動態修飾：甲硫氨酸（Methionine）氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺（Asparagine & Glutamine）脫氨基化（+0.984 Da）；酶：trypsin；漏切位點：2。數據庫來自UNIPROT（http：//www. uniprot.org/）。

1.2.8 差異表達蛋白的GO（Gene Ontology）分析根據蛋白數據庫中的各蛋白GO注釋，并結合其來源，人工選擇鑒定所得到的蛋白最可能的細胞成分、分子功能和生物學途徑，并對其進行基因富集度計算和圖示化。鑒定蛋白的GO信息來自UNIPROT網站（http：//www.uniprot.org/）。

2 結果

2.1 小麥葉片總蛋白的提取分析與SDS-PAGE電泳

小麥葉片通過TCA/丙酮沉淀，用UA裂解液溶解，通過Bradford法進行定量，測出TYr10中蛋白濃度為7.80 mg/mL，T29提取蛋白濃度為8.01 mg/mL，計算得出總蛋白的提取率分別為0.58%和0.60%。通過SDS-PAGE（圖1）對提取結果進行檢測發現，兩組樣品之間平行度較好，相應的蛋白條帶清晰，初步表明蛋白提取效果理想，樣品純度適于進行下一步工作。

圖1 小麥葉片總蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 液相色譜串聯質譜鑒定

將蛋白粗樣品復溶、酶切之后，經過Easy-nLC 1000液相系統進行色譜分離，并通過Q Exactive進行質譜分析（3次技術重復），得到的數據進行Mascot搜索，共鑒定到2 257個蛋白。對已鑒定蛋白通過嚴格標準進行篩選（peptide FDR & protein FDR≤1%），且設定每個蛋白需有兩條以上肽段提供定量比值，最終確定具有可靠定量信息的蛋白有1 549個（數據略）。

2.3 差異表達蛋白篩選結果及其GO分析

在上述具有定量信息的1 549個蛋白中，共篩選出蛋白表達水平差異大于2倍，且3次技術重復RSD<50%的蛋白102個，其中低表達31個，高表達71個（表1）。這些蛋白的相對分子量（MW）分

布為4.42 kD（D2K937）-164.95 kD（M7ZSA1），等電點（pI）分布為4.71（M7Z596）-12.01（Q95H53），相對分子量和理論等電點分布廣泛。

表1 質譜數據分析差異蛋白結果（TYr10 vs T29）

續表

按照UNIPROT（http://www.uniprot.org/）數據庫中的各蛋白質的GO注釋分別進行細胞成分、分子功能和生物學途徑分類。結果（圖2）顯示，102個差異蛋白中有63個沒有明確的亞細胞定位，其余主要來源于細胞基質（36.3%）與核糖體（23.6%）等細胞器；分子功能涉及結合（41.2%）、催化（37.3%）等方面；生物學途徑GO分析表明，這些蛋白主要參與代謝（58.8%）、細胞過程（50.0%）、應激（3.9%）等生物學進程。這些蛋白中，具有細胞成分（Cellular component）GO注釋信息的蛋白39個，占總差異蛋白的38.2%，其中細胞基質蛋白37個，基質蛋白中也分布于核糖體、細胞核和膜系統的蛋白分別為24、8和3個，另有2個膜蛋白不分布于細胞基質；具有分子功能（Molecular function）GO注釋信息的蛋白85個，占到總差異蛋白的84.3%，其中具有結合功能的蛋白42個，在這42個蛋白中也具有催化活性、結構大分子功能的蛋白分別為21個和5個，具有催化活性的蛋白一共是38個，其中1個同時具有大分子結構功能，另有7個具有其他分子功能的蛋白；具有生物學途徑（Biological process）GO注釋信息的蛋白75個，占總差異蛋白的73.6%，其中代謝途徑相關蛋白60個，在這60個蛋白中同時與細胞進程、應激反應、轉運過程以及生物調節過程相關的蛋白分別有41、2、1和5個。與細胞進程相關的蛋白一共有51個，其中同時與轉運以及生物調節過程相關的蛋白分別為3個和6個。應激反應、轉運過程和生物調節過程相關的蛋白總數分別為4、 6和7個。

圖2 T29與TYr10葉片間差異蛋白的GO注釋圖

3 討論

樣品制備是質譜非標記定量分析的關鍵步驟之一，其成功與否對研究結果影響巨大，但目前還沒有一種提取植物葉片完整蛋白質的標準方法［19］。由于小麥等植物葉片中含有RuBisCo等一些高拷貝數的持家蛋白，可能導致某些調控因子和信號因子等低豐度蛋白難以檢測，對樣品進行去除高豐度蛋白處理可以在一定程度上緩解此類問題，然而此類方法成本昂貴或操作步驟復雜，容易造成蛋白的丟失［20，21］。本研究運用TCA/丙酮沉淀法對小麥葉片總蛋白進行提取，蛋白提取率分別為0.58%和0.60%，達到目前的一般標準［9，22］，在此基礎上首次運用質譜非標定量法對TYr10與T29進行了比較蛋白質組學研究。結果顯示，在兩個樣品中共鑒定到2 257個蛋白，其中具有準確定量信息的蛋白1 549個，從已定量的蛋白中共篩選到102個差異表達蛋白。

由于在不同真核生物中的大多數基因擁有相似的生物學功能，因此在某些物種獲得基因或蛋白質的生物學信息可輔助揭示其他物種中相應基因或蛋白質的功能，綜合這些信息的GO注釋目前已成為功能基因生物信息學分析的核心內容之一［23，24］。本研究從GO數據庫中獲取了102個差異表達蛋白所屬的細胞成分、生物學途徑和分子功能的GO注釋，并人工對差異蛋白進行GO功能分析和圖示化。這一結果表明該鑒定蛋白質組數據具有較好的生物學功能覆蓋范圍，包括光合作用、糖代謝以及能量代謝等一系列生物過程，這與報導過的植物抗病相關

研究結果相一致［25-27］。

在已鑒定的差異蛋白中，代謝相關蛋白60個，其中Q96185為超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）。SOD廣泛存在于真核細胞與原核細胞的細胞質、線粒體和葉綠體中，可清除生物體內超氧陰離子自由基，有效地抵御氧自由基對有機體的傷害［28］，研究還發現大豆在感染SMV后引起了活性氧的累積，誘導防御酶活性的增強，從而使SOD活性的上升［29］，而SOD在TYr10中表達有明顯上升可能與其抗病性有關。M7Z0K9為甲硫氨酰氨肽酶（Methionine aminopeptidase，MetAP）。MetAP在細胞內的主要功能是切除細胞內新合成蛋白的N端甲硫氨酸，在細胞信號轉導、蛋白互作、腫瘤生長以及細菌和病毒感染等生理病理過程發揮著重要的作用［30，31］，但是與TYr10的抗病性的關系尚不清楚。M7ZME5為溶酶體-β-葡萄糖苷酶（Lysosomal beta glucosidase）。馬成等［8］曾報道Taichung29*6/Yr5葉片在接種條銹菌CYR32后β-葡萄糖苷酶水平下降，本研究發現溶酶體-β-葡萄糖苷酶在未接種的TYr10中表達較T29低，提示該蛋白可能與抗病性有一定相關性。本研究還鑒定到6個與運轉相關的差異蛋白，其中Q5G1L6為鐵蛋白（Ferritin）。鐵蛋白廣泛存在于動物、植物和微生物體內，在植物中作為專門的貯鐵蛋白，是植物光合作用和固氮等生化反應的鐵源，不僅調節體內鐵的含量，而且是一種重要的脅迫反應蛋白，在植物的發育、抵抗氧化損害等方面發揮重要的作用［32］，該蛋白在TYr10中的高表達可能與其抗病性有關。此外，還鑒定到4個應激反應相關的差異蛋白，其中M7Z2R9（Putative disease resistance protein RXW24L）與Q6PWL8（Putative vacuolar defense protein）在TYr10表達明顯提高，可能與該近等基因系的抗病機制相關，值得進一步研究。多年來，育種工作者一直以選育和推廣抗病品種作為病害的主要防治手段，且頗見成效，但小麥抗條銹性喪失和抗條銹病機理一直是未能解決的問題。對近等基因系Taichung 29*6/Yr10差異表達蛋白的分析，為理解小麥抗條銹性喪失和研究Yr10基因的抗條銹病機理提供了新的線索和思路。

4 結論

利用質譜非標定量技術可有效地進行小麥蛋白質組定量分析，運用該技術從小麥抗病單基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10和背景品種Taichung 29葉片中共鑒定到102個差異表達蛋白。已鑒定到的差異表達蛋白大多定位于細胞基質以及核糖體等細胞器，具備結合、催化等功能，主要參與代謝、細胞過程、應激等生物學進程，其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶體-β-葡萄糖苷酶和鐵蛋白等可能與小麥抗病單基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10的抗病性有一定相關性。

致謝：質譜分析和數據處理得到賽默飛世爾科技（中國）有限公司色譜與質譜部聶愛英博士的幫助。

［1］ Wan A, Zhao Z, Chen X, et al. Wheat stripe rust epidemic and virulence ofPuccinia striiformisf. sp.triticiin China in 2002［J］. Plant Disease, 2004, 88（8）：896-904.

［2］ Wan A, Chen X, He Z. Wheat stripe rust in China［J］. Crop and Pasture Science, 2007, 58（6）：605-619.

［3］ Wellings CR. Global status of stripe rust：a review of historical and current threats［J］. Euphytica, 2011, 179（1）：129-141.

［4］ Zeng SM, Luo Y. Long-distance spread and interregional epidemics of wheat stripe rust in China［J］. Plant Disease, 2006, 90（8）：980-988.

［5］ Wan A, Chen X. Virulence, frequency, and distribution of races ofPuccinia striiformisf. sp.triticiandP.striiformisf. sp.hordeiidentified in the United States in 2008 and 2009［J］. Plant Disease, 2012, 96（1）：67-74.

［6］ Cox J, Mann M. Is proteomics the new genomics?［J］. Cell, 2007, 130（3）：395-398.

［7］ Rampitsch C, Bykova NV, McCallum B, et al. Analysis of the wheat andPuccinia triticina（leaf rust）proteomes during a susceptible host-pathogen interaction［J］. Proteomics, 2006, 6（6）：1897-1907.

［8］ 馬成, 徐世昌, 徐琴, 等.抗條銹病小麥品系Taichuang29*6/ Yr5接種條銹菌CY32后的蛋白質組學分析［J］.中國農業科學, 2009, 42（5）：1616-1623.

［9］ 胡新明, 楊友才, 潘映紅.小麥葉片胞間洗脫液的蛋白質組學

檢測分析［J］.生物技術通報, 2011（8）：91-98.

［10］ Jorrín-Novo JV, Maldonado AM, Echevarría-Zome?o S, et al. Plant proteomics update（2007-2008）：second-generation proteomic techniques, an appropriate experimental design, and data analysis to fulfill MIAPE standards, increase plant proteome coverage and expand biological knowledge［J］. Journal of Proteomics, 2009, 72（3）：285-314.

［11］ Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation inSaccharomyces cerevisiaeusing amine-reactive isobaric tagging reagents［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2004, 3（12）：1154-1169.

［12］ Gygi SP, Rist B, Gerber SA, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags［J］. Nature Biotechnology, 1999, 17（10）：994-999.

［13］ Kang UB, Yeom J, Kim H, et al. Quantitative analysis of mTRAQ-labeled proteome using full MS scans［J］. Journal of Proteome research, 2010, 9（7）：3750-3758.

［14］ Erba EB, Bergatto E, Cabodi S, et al. Systematic analysis of the epidermal growth factor receptor by mass spectrometry reveals stimulation-dependent multisite phosphorylation［J］. Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4（8）：1107-1121.

［15］ Wang G, Wu W, Pisitkun T, et al. Automated quantification tool for high-throughput proteomics using stable isotope labeling and LCMSn［J］. Anal Chem, 2006, 78（16）：5752-5761.

［16］ Zhang K, Chen Y, Zhang Z, et al. Identification and verification of lysine propionylation and butyrylation in yeast core histones using PTMap software［J］. Journal of Proteome Research, 2008, 8（2）：900-906.

［17］ 劉偉霞, 潘映紅.適用于小麥葉片蛋白質組分析的樣品制備方法［J］.中國農業科學, 2007, 40（10）：2169-2176.

［18］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Analytical Biochemistry, 1976, 72（1）：248-254.

［19］ Bodzon-Kulakowska A, Bierczynska-Krzysik A, Dylag T, et al. Methods for samples preparation in proteomic research［J］. Journal of Chromatography B, 2007, 849（1）：1-31.

［20］ Kim ST, Cho KS, Jang YS, et al. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays［J］. Electrophoresis, 2001, 22（10）：2103-2109.

［21］ Cellar NA, Kuppannan K, Langhorst ML, et al. Cross species applicability of abundant protein depletion columns for ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase［J］. Journal of Chromatography B, 2008, 861（1）：29-39.

［22］ 劉靜, 潘映紅, 徐琴, 等.小麥葉片蛋白質組的2D-LC分離及Nano LC-MS/MS分析［J］.中國農業科學, 2009, 42（3）：772-780.

［23］ Matis M, ?akelj-Mavri? M, Peter-Katalini? J. Mass spectrometry and database search in the analysis of proteins from the fungusPleurotus ostreatus［J］. Proteomics, 2005, 5（1）：67-75.

［24］ Wu X, Zhu L, Guo J, et al. Prediction of yeast protein-protein interaction network：insights from the Gene Ontology and annotations［J］. Nucleic Acids Research, 2006, 34（7）：2137-2150.

［25］ Li Y, Zhang Z, Nie Y, et al. Proteomic analysis of salicylic acidinduced resistance toMagnaporthe oryzaein susceptible and resistant rice［J］. Proteomics, 2012, 12（14）：2340-2354.

［26］ Bernardo L, Prinsi B, Negri AS, et al. Proteomic characterization of the Rph15 barley resistance gene-mediated defence responses to leaf rust［J］. BMC Genomics, 2012, 13（1）：1-16.

［27］ Zhao F, Fang W, Xie D, et al. Proteomic identification of differentially expressed proteins inGossypium thurberiinoculated with cottonVerticillium dahliae［J］. Plant Science, 2012, 185：176-184.

［28］ 陳鴻鵬, 譚曉風.超氧化物歧化酶（SOD）研究綜述［J］. 經濟林研究, 2007, 25（1）：59-65.

［29］ 欒曉燕, 陳怡, 杜維廣, 等.不同抗性大豆品種感染SMV后過氧化物酶, 多酚氧化酶, 超氧化物歧化酶的變化分析［J］.大豆科學, 2001, 20（3）：200-203.

［30］ Chang SY, McGARY EC, Chang S. Methionine aminopeptidase gene of Escherichia coli is essential for cell growth［J］. Journal of Bacteriology, 1989, 171（7）：4071-4072.

［31］ Cutforth T, Gaul U. A methionine aminopeptidase and putative regulator of translation initiation is required for cell growth and patterning inDrosophila［J］. Mechanisms of Development, 1999, 82（1-2）：23-28.

［32］ Andrews SC, Harrison PM, Yewdall SJ, et al. Structure, function, and evolution of ferritins［J］. Journal of Inorganic Biochemistry, 1992, 47（1）：161-174.

（責任編輯 馬鑫）

Label-free Quantitative Proteomics Analysis of a Wheat Near-isogenic Line Pair with Q Exactive Mass Spectrometer

Huang Yu1，2，3Feng Jing4Rao Liqun1Xu Shichang4Pan Yinghong2，3
（1. College of Bbioscience and Biotechnology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128；2. Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing 100081；4. Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

In this study, the protein expression of a wheat near-isogenic line pair, Taichung 29*6/Yr10 and Taichung 29, have been compared with label-free quantitative proteomic approach based on liquid chromatography tandem Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. By MASCOT database search, a total of 2 257 proteins were identified from both of the samples, and among of them 1 549 proteins were accurately quantitated and 102 differentially expressed proteins（>2 fold）were detected. Gene ontology（GO）analysis showed that these differential proteins were mainly localized to cell matrix and organelles such as ribosome, and mainly involved in binding and catalytic functions. Among of 102 proteins which mainly take part in metabolic, cellular and stress responses processes, Superoxide dismutase, Methionine aminopeptidase, Lysosomal-β-glucosidase, and Ferritin may play some important roles in Taichung 29*6/Yr10 resistance to Yellow rust.

Wheat Yellow rust Resistance Proteomics Label-free quantitation Q Exactive Mass Spectrometer

2013-12-16

國家“863”高技術研究發展計劃（2008AA10Z115），國家自然科學基金項目（30971874），轉基因生物新品種培育科技重大專項（2009ZX08012-011B）

黃宇，男，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：nictkk@163.com

潘映紅，男，研究員，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：panyinghong@caas.cn