擬南芥NDR1基因介導的廣譜抗病性研究進展

龔前園 張超 李為民 張永強

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

擬南芥NDR1基因介導的廣譜抗病性研究進展

龔前園 張超 李為民 張永強

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

抗病基因的研究是抗病育種及防治植物病害的基礎。擬南芥NDR1（Non-race-specific disease resistance 1）基因，編碼一個質膜定位蛋白，在R基因介導的抗性中具有重要作用。NDR1能與CC-NB-LRR（卷曲螺旋核酸結合或富亮氨酸重復）類抗病蛋白相互作用。以擬南芥抗病基因NDR1及其蛋白結構的研究進展為基礎，綜述了NDR1的廣譜抗病性和抗病分子機理。

抗病基因 NDR1 CC-NB/LRR

植物在生長發育過程中會經常受到細菌、真菌和病毒等病原體的侵襲，其結果表現為抗病或感病。在與病原體長期的相互作用與進化過程中，植物逐漸形成了復雜的防御機制。一般認為，植物通過抗性（R）基因與病原體無毒基因（Avr基因）的互作，激活植物的防御反應［1，2］。大多數植物的R蛋白具有核苷酸結合位點（Nucleotide-binding site，NBS）和富亮氨酸重復序列（Leucine-rich repeat，LRR）的結構特點。NBS具有ATP或GTP結合活性，LRR結構域調節蛋白質-蛋白質相互作用，起著確定基因對基因間互作的直接特異性［3］。NBS-LRR類R基因，根據其N端的結構域特點，可進一步分為卷曲螺旋結構域（CC）NBS-LRR類與果蠅Toll蛋白和哺乳動物白細胞介素I受體同源域（TIR）NBS-LRR類［4］。

雖然R蛋白在感知病原體后的激活抗性過程中發揮著核心作用，但單靠 R蛋白啟動抗性是不夠的。因此，作為抗性共激活因子的眾多輔助蛋白和伴侶蛋白也已被確定。例如，Enhanced disease susceptibility 1（EDS1）通過激活R蛋白的TIR結構域調控防御信號，而Non-race-specific disease resistance 1（NDR1）是含有CC結構域的R蛋白激活所必需的［5-9］。但也有例外，幾個CC-NB-LRR 類R蛋白對卵菌綱病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis的特異抗性獨立于NDR1之外起作用［10，11］。因此，雖然EDS1和NDR1依靠R蛋白的結構特異性、功能和激活信號似乎是保守的，但這些途徑相關的完整機制仍不清楚。

激活R蛋白介導的抗性所需的兩個主要信號元件中，EDS1研究的比較清楚。EDS1作為涉及生物和氧化應激信號的核心調控蛋白［12］。細菌感染植

物后，EDS1通過與植保素缺陷蛋白4（Phytoalexindeficient 4）和衰老相關基因101（Senescence-associated gene101）的互作，誘發超敏反應（HR）［13，14］。EDS1也被證明在阻止非致病真菌侵入增長以及運作氧化應激信號中起作用［12］。相反，NDR1在CC-NBLRR類的信號轉導通路中的功能尚不清楚。故筆者著重對近年來對NDR1基因的研究進展進行綜述。

1 NDR1基因的結構

Century等［6］在研究擬南芥與丁香假單胞菌（Pst）之間的互作時，發現了一個可能涉及擬南芥抗病途徑的基因，由于其具有非小種專化抗病性，故命名為NDR1。NDR1基因位于擬南芥第3條染色體上，限制性片段長度多態性（RFLP）標記出其位于g6220與g4711之間的8.5厘摩（cM）［6］。NDR1蛋白是一個質膜蛋白，它經歷了幾個翻譯后修飾，包括羧基末端處理和氨基端糖基化［7，8］。基因組DNA序列分析顯示，NDR1含有一個單一的660個堿基對的開放閱讀框（ORF）［7］。

2 NDR1蛋白的結構

Coppinger等［8］通過序列分析預測NDR1是一個C末端糖基肌醇（GPI）錨定蛋白，并通過選擇離子監測質譜法（SIM-MS）得到驗證。NDR1蛋白的結構如圖1所示，其中ω位點、斷裂位點和疏水尾巴為GPI錨定蛋白的基本特點。Knepper等［16］通過與整合素蛋白LEA14進行同源建模，預測了NDR1蛋白的高級結構（圖2）。對預測結果進行進一步分析發現該蛋白與涉及信號感知和先天免疫反應的哺乳動物整合素蛋白具有幾個驚人的相似之處。例如，大量的β折疊的圓環（圖2-A 藍色箭頭）類似于Ⅲ型纖連蛋白的核心結構。進一步的模擬表明NDR1的主要核心結構與膜結合亞單位（即纖連蛋白域）FNIII具有很強的相似性，NDR1和整合的假定跨膜結構域都連接到一個大的單一β片上［17］。根據相鄰的3個氨基酸的α-螺旋結構（圖2-B），他們確定了在溶劑中暴露的氨基酸178-180位置存在的一個類似整合素蛋白Arg-Gly-Asp（RGD）的NGD結構域（Asn-Gly-Asp）。在宿主-真菌互作中，防御信號中的NGD域是一個潛在的配體結合位點，該位點涉及胞壁質膜黏附［18，19］。此外，據推測NGD位點也是病原菌效應蛋白和分泌系統的靶標，大概是為了通過破壞細胞壁質膜黏著斑而方便病原體進入［20］。

圖1 NDR1的結構［8］

圖2 NDR1蛋白的高級結構［16］

3 NDR1在抗病信號轉導中的作用方式

通過突變體刪除試驗表明，NDR1是一個重要的誘導防御反應的抗性基因，并具有非小種專化抗病性［6］。在過去的10多年中，通過闡明NDR1參與的遺傳相互作用，發現NDR1參與了植物防御信號，并作為防御信號激活所需的核心元件，激活CC-NB-LRR 類R蛋白［9］。擬南芥突變體ndr1-1植株中，由細菌引起的水楊酸（Salicylic acid，SA）或通過UV-C光或缺氧產生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）都被減弱了，并且在由細菌或ROS誘導的SAR也受損，但BTH誘導的SAR不受影響。從而表明，NDR1在ROS的下游和SA的上游發揮功能［21］。 結合以上分析，Shapiro等［21］總結了抗病信號轉導模型，明確了NDR1在抗病信號轉導中的作用位置，如圖3所示。

4 NDR1基因的抗病性

4.1 擬南芥NDR1的抗病性

通過突變體ndr1-1的感病性檢測，NDR1對攜帶無毒基因avrB、avrRpm1、avrRpt2和avrPph3中任何一個的丁香假單胞菌具有抗性［6］。同時，NDR1

的突變嚴重削弱了擬南芥在響應攜帶無毒基因avrRpt2的丁香假單胞菌時HR和SAR的誘導能力，也降低了突變體植株PR1基因的表達水平［21］。

圖3 抗病信號轉導模型［21］

Coppinger等［8］研究轉基因擬南芥的ndr1-1補充突變體發現，該基因開放讀碼框上游的一個1.3 kb區域，足以驅動NDR1基因的表達。在這個1.3 kb‘NDR1本地啟動子’的啟動下，能穩定地在轉基因擬南芥ndr1-1突變體中表達NDR1，從而實現在擬南芥中過量表達NDR1。其結果是，可以增強擬南芥對一些細菌的抗病能力，如番茄丁香假單胞菌，但對非細菌性病原菌的抗性增強不明顯，如蕪菁皺縮病毒和白粉病。通過抗病基因工程研究NDR1的功能也有報道。竇道龍等［22］利用農桿菌介導法，將從擬南芥Wassilewskija生態型中克隆到的NDR1基因轉到煙草中發現，部分轉基因苗（約30%）對赤星病和晚疫病的抗性明顯增強。人們在擬南芥中發現了45個與NDR1和HIN1（煙草中與NDR1序列相似的抗病基因）相關的基因，它們屬于NHL（似NDR1/HIN1）大家族［23，24］。這些基因不同程度地參與了植物防御途徑，如NHL10在黃瓜花葉病毒引起的過敏反應中被誘導表達［24］。

因此，NDR1基因確實參與了植物的抗病反應，而且與NDR1序列相似的基因也可能具有抗病性，這為廣泛克隆并研究植物抗病基因奠定了基礎。

4.2 其他植物NDR1基因的抗病性

近年來，人們對其他植物中的NDR1同源基因的抗病性也做了一定的研究。例如，Cacas等［25］從咖啡中克隆到了與擬南芥NDR1功能上同源的基因CaNDR1a，它能恢復ndr1-1對丁香假單胞菌的抗性。同時，他們還通過瞬時表達系統，確定CaNDR1a蛋白和擬南芥NDR1蛋白一樣也通過C末端處理定位于質膜上，且與類似RIN4的蛋白互作，從而證明了NDR1蛋白在咖啡和擬南芥之間的功能上和生化特性上的保守性。Lu等［26］克隆了柑橘中的NDR1同源基因，即CsNDR1，并證實過表達CsNDR1能彌補擬南芥突變體ndr1-1對丁香假單胞菌的抗性，也能增強對卵菌綱病原體Hyaloperonospora arabidopsidis的抗性。這種過表達與SA產物的增加和防御標記蛋白PATHOGENESIS RELATED 1（PR1）的表達正相關，這說明CsNDR1的過表達可激活SA介導的防御信號，從而導致廣譜抗病性的產生。此外，他們還發現，在感染與柑橘火龍病相關的細菌病原體CandidatusLiberibacter的柑橘中，能誘導溫和的PR1的表達和SA的積累，從而進一步證實CsNDR1是擬南芥NDR1的一個功能性同源基因。

總之，NDR1基因介導了植物的廣譜抗病性，并且它在一些植物的防御途徑之間是保守的。因此我們可以通過克隆一些抗病植物的NDR1同源基因，通過基因工程的方法將NDR1基因轉化到其他經濟植物中，以提高目標植物的抗病性。

4.3 NDR1的抗病分子機理

人們廣泛認為，R蛋白介導的植物對細菌抗性的分子遺傳基礎，涉及直接或間接的識別來源于病原體的毒力效應器，從而誘發植物的抗病性［27，28］。細菌III型效應蛋白通過III型分泌系統進入植物細胞質，識別寄主植物并激活防御信號形成抗性。當效應蛋白被寄主植物識別時，就會產生基因對基因的抗性，從而啟動抗病反應。

Coppinger等［8］通過抗原標記NDR1轉化到擬南芥ndr1-1中，再利用免疫印跡證實NDR1通過C末端糖基肌醇（GPI）錨定到質膜上，GPI可能在膜的外表面修飾NDR1，從而使NDR1與外源病原體信號直接或間接相互作用。Knepper等［16］通過同源建模，預測NDR1與擬南芥胚胎發育晚期富集蛋白14（與非生物脅迫響應有關的蛋白）的結構高度相似。

特定的蛋白質超二級結構也表明NDR1與哺乳動物整合素具有驚人的相似性，整合素能調節細胞外基質和脅迫信號之間的相互作用。ndr1-1突變體植物感染病原體后，與野生型Col-0相比，表現出較高的電解液泄漏。 此外，還觀察到質壁分離的表型改變，這表明NDR1能通過調節在環境壓力下發生的細胞液損失，從而保持細胞壁質膜的粘連。

NDR1是一個質膜定位、GPI錨定的蛋白質，能夠形成同型二聚體。 NDR1包含一個位于該蛋白質外體的NGD結構域（Asn-Gly-Asp），該結構域能通過直接或間接的相互作用將細胞壁和質膜連接在一起（圖4中小標1，2）。通過鑒定NDR1與RIN4的相互作用，人們進一步認識了NDR1在效應器觸發免疫（Effector-triggered immunity，ETI）中的作用：NDR1通過與RIN4的互作及隨后R蛋白的負調節作用，至少部分地，正向調節了抗性反應［29］。目前尚不清楚介導NDR1與ETI聯系的其他細胞元件。RIN4能與R蛋白RPS2互作，并通過RIN4的分開來識別丁香假單胞菌DC3000的效應蛋白AvrRpt2，隨后被RPS2識別并激活ETI。最近發現，NDR1能激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑和PTI。NDR1與PTI上游的具體互作元件仍未確定（圖4中小標3）。

圖4 NDR1在細胞生理和病原體防御信號中扮演的角色［30］

5 展望

NDR1通過C末端錨定到質膜上，在細胞質內通過與抗病蛋白RPS2及負調節蛋白RIN4的相互作用參與抗病信號轉導，從而使抗病信號從細胞外空間轉導到細胞內［29］。同時，HR過程中產生的ROS也作用于NDR1［21］。抗病信號進一步傳遞，產生SA，促進病程相關基因的表達。NDR1基因介導了植物的廣譜抗病性，并且它在防御途徑中的功能在很多植物之間是保守的。因此可以通過對保守序列的分析，克隆一些抗病植物的NDR1同源基因或與NDR1序列相似的基因，然后通過基因工程的方法將這些基因轉移到其他植物中，并實現穩定表達，從而提高目標植物對各種病原菌的廣譜抗性。

目前雖然已經確定NDR1參與抗病信號轉導，并對擬南芥NDR1的抗病性做了一定的研究。但對NDR1在信號轉導通路中的功能及其抗病分子機理的研究不多，而且大多處于推論階段，需要進一步的試驗技術來證明。鑒于NDR1基因的廣譜抗病性，其在作物廣譜抗病基因工程中具有較大的應用前景。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advances of NDR1 Gene Determined Broad-spectrum Disease Resistance in Arabidopsis

Gong Qianyuan Zhang Chao Li Weimin Zhang Yongqiang
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

The research of resistance genes is the basis of disease resistance breeding and plant diseases controlling. Arabidopsis NDR1（non-race-specific disease resistance 1）gene, encoding a plasma membrane protein, plays an important role in the R gene mediated disease resistance, by interacting with CC-NB-LRR（nucleic acid binding or coiled-coil leucine-rich repeat）class of antiviral proteins. Here, we summarized the latest progresses of Arabidopsis NDR1 gene and the broad-spectrum disease resistance of NDR1.

Disease resistance gene NDR1 CC-NB-LRR

2013-12-03

國家轉基因生物新品種培育重大專項（2011ZX08001-002）

龔前園，男，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學與基因工程；E-mail：gqyscnc@sina.cn

張永強，男，研究員，研究方向：植物分子生物學；E-mail：zhangyongq@sina.com