高等植物硝酸鹽轉運蛋白的功能及其調控機制

賈宏昉 張洪映 劉維智 崔紅 劉國順

（河南農業大學煙草學院 國家煙草栽培生理生化基地，鄭州 450002）

高等植物硝酸鹽轉運蛋白的功能及其調控機制

賈宏昉 張洪映 劉維智 崔紅 劉國順

（河南農業大學煙草學院 國家煙草栽培生理生化基地，鄭州 450002）

硝酸鹽是植物從土壤中吸收的重要無機氮素形態。植物為適應含有不同濃度NO3-的土壤環境，進化出了高親和硝酸鹽轉運系統（HATS）和低親和硝酸鹽轉運系統（LATS），兩個基因家族NRT1和NRT2家族分別參與了LATS和HATS的NO-3的吸收和轉運。近年來，隨著分子生物學技術和植物基因組學的快速發展，研究人員克隆出了大量參與硝酸鹽吸收和轉運的基因，并對這些基因的功能進行了深入研究，逐漸形成了復雜的硝酸鹽調控網絡。綜述了植物中硝酸鹽轉運蛋白基因的克隆、表達及調控，并對進一步的研究作了展望，這些結果對于理解植物硝酸鹽吸收的調控機制具有重要作用。

高等植物 硝酸鹽轉運蛋白 調控機制 進展

氮素是植物體最重要的礦質營養元素，對植物的生長發育、產量及品質形成起著重要的作用［1］。銨態氮（NH4+）和硝態氮（NO3-）是植物從土壤中吸收的兩種主要的礦質氮源。在通氣良好的旱田土壤中，植物主要是以NO-為主要氮源；而在淹水的

3狀態下，土壤中的氮素主要是以銨態氮（NH4+）形式存在［2］。NO3-不僅可以作為營養物質調控植物的生長，還可以作為重要的信號物質調控下游基因的轉錄、種子萌發、氣孔活動以及植物形態發展［3，4］。到目前為止，在擬南芥、水稻、大麥等植物上已克隆多個硝酸鹽轉運蛋白［2，5］。人們對植物吸收NO-3的分子生物學基礎已經有了相當了解，這方面的研究將有助于人們更好地理解植物是如何吸收氮素以及這種吸收過程是如何受到調控的，對今后進行作物氮高效品種改良具有重要意義。

1 植物硝酸鹽轉運蛋白的生理功能

植物根系從土壤中吸收NO-、植物體內NO-的

33運輸和細胞內NO3-再分配都需要硝酸鹽轉運蛋白來執行，編碼硝酸鹽轉運蛋白主要有NRT1和NRT2家族，分別負責低親和（LATS）和高親和（HATS）

硝酸鹽轉運系統。當外界NO3-濃度在1 μmol/L-1 mmol/L時，負責NO3-的吸收主要是高親和轉運系統（HATS）；而當外界NO3-濃度高于1 mmol/L時，NO3-吸收的主要由低親和轉運系統（LATS）負責［6，7］。HATS又包括誘導型高親和轉運系統（iHATS）和組成型高親和轉運系統（cHATS）；LATS又包括誘導型低親和轉運系統（iLATS）和組成型低親和轉運系統（cLATS）［5］。隨著分子生物學研究技術和生物信息學的日趨成熟，很多參與硝酸鹽轉運的基因已經被相繼分離、克隆，并對其功能做了較為深入的鑒

定（圖1）［7］。

圖1 擬南芥硝酸鹽轉運蛋白的分布［7］（顏色標識見電子版）

1.1 NRT1家族轉運蛋白

植物中NRT1屬于小肽轉運體（Peptide transporters，PTR）家族，一般含有450-600個氨基酸，有12個跨膜結構域，在NRT1的第6個和第7個跨膜域之間有一個大的親水環狀結構。雙子葉植物擬南芥NRT1家族有53個成員基因，其中CHL1（AtNRT1.1）是最早被克隆的NRT1家族成員［8］，隨后大量擬南芥中NRT1成員基因被克隆出來。繼AtNRT1.1基因以后，人們又在擬南芥中克隆到多個NRT1基因，其中AtNRT1.2是一個組成型表達基因，是擬南芥cLATs的成員［9］。該基因與AtNRT1.1有所不同，AtNRT1.2只具有低親和力硝酸鹽轉運特性的轉運蛋白，并不具有高親和力硝酸鹽轉運特性。AtNRT1.4主要在葉柄及葉脈表達，可以調控硝酸鹽在葉片的分配［10］；AtNRT1.5主要在根部靠近木質部的薄壁細胞表達，主要負責將硝酸鹽向木質部運輸，從而調控硝酸鹽由地下向地上的長距離運輸［11］；與AtNRT1.5不同的是AtNRT1.8在地上部及地下部靠近木質部的薄壁細胞都有表達，通過將木質部的硝酸鹽向外運出調控硝酸鹽在地上及地下的分配［12］；AtNRT1.6主要通過調控硝酸鹽從母體向胚的運輸影響胚的早期發育［13］；AtNRT1.7主要在葉片韌皮部的薄壁細胞表達，負責將硝酸鹽向韌皮部運輸從而調控衰老葉片中硝酸鹽的再利用［14］；而AtNRT1.9主要在根部韌皮部細胞表達，通過將硝酸鹽向根系韌皮部運輸調控硝酸鹽的分配和再利用［15］。

到目前為止，人們已在番茄（Lycopersicon esculentum）、水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana plumbaginifolia）、油菜（Brassica napus）和苜蓿（Medicago truncatula）等植物中都克隆到了NRT1家族基因，其中水稻NRT1家族成員最多，至少有100多個［16］。大量的研究表明NRT1家族基因并不一定只是低親和硝酸鹽運輸蛋白，已報道的擬南芥CHL1和苜蓿MtNRT1.3被驗證是雙親和硝酸鹽運輸蛋白［17-19］。

1.2 NRT2家族轉運蛋白

NRT2屬于硝酸鹽-亞硝酸鹽轉運體家族，該家族屬于MFS（Major facilitator superfamily，MFS）超家族成員。第一個NRT2家族基因是在真核生物曲霉菌（Aspergill usnidulans）中克隆到的CrnA（NRTA）基因［20］，將CrnA基因注射蟾卵異源表達系統后發現，硝酸鹽的跨膜運輸有2種機制：介質NO3-濃度較低時，是H+偶聯的2H+/1NO3-共轉運的主動轉運機制，Km值為24 μmol/L［21］；當介質NO3-濃度較高時采用被動吸收機制吸收NO3-，Km值為127 μmol/L［22］。但是植物的HATS似乎只是單一的2H+/1NO3-共轉運系統。自從真菌中克隆到CrnA基因之后，人們隨后在單細胞綠藻（Chlamydomonas reinhartii）和海洋藍藻（Marine cyanobacterium）也分離到NRT2基因［23，24］。最早分離的植物NRT2基因是大麥基因HvNRT2.1和HvNRT2.2［25］。到目前為止，人們已在不同高等植物中分離到幾十個NRT2基因。在同一種植物中，一般有多個NRT2基因，如在大麥中可能有7-10個NRT2基因，但是目前只克隆到其中的4個；在擬南芥中可能有7個NRT2基因。在水稻中已經克隆的高親和硝酸鹽運輸蛋白基因有OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3和OsNRT2.4及兩個NAR2s（OsNAR2.1和OsNAR2.2），其中OsNRT2.3又通過選擇性剪切轉錄成OsNRT2.3a和OsNRT2.3b兩個轉錄本［26-28］。Tang等［28］的研究表明OsNRT2.3a在水稻硝酸鹽從地下部向地上部運輸過程中起關鍵作用，而OsNRT2.3b在水稻前期氮素積累和后期氮素轉運中發揮關鍵作用，該基因過量表達顯著提高了水稻的氮素利用效率和產量。最近本課題組利用RACEPCR方法從普通煙草（Nicotiana tabacum）中克隆出來5個高親和硝態氮轉運蛋白基因（NtNRT2.1-NtNRT2.5），其中NtNRT2.1為已報道的基因，其余4個基因均未報道，初步結果表明其余4個基因均受硝酸鹽誘導增強表達。

目前已有的報道表明部分單獨的高親和磷轉運蛋白并不具有NO3-轉運功能，其功能的發揮依賴于NAR2蛋白的輔助。在綠藻中Zhou等［29］利用蟾卵異源表達系統證實只有同時注射CrNRT2.1和CrNAR2的mRNA的蟾卵才具有NO3-的運輸活性。高等植物也具有這種雙組份運輸系統，Tong等［30］從大麥上克隆得到3個NAR2s類似的基因，將3個NAR2和HvNRT2.1mRNA分別注射到蟾卵時，只有HvNAR2.3和HvNRT2.1同時注射時才有硝態氮

運輸活性。在植物上的研究表明NAR2和NRT2蛋白之間作用也不是特異的，Orsel等［31］通過酵母雙雜交和蟾卵異源表達證明在擬南芥中AtNAR2.1與AtNRT2.1蛋白相互作用行使硝酸鹽運輸功能，同時他們在酵母雙雜交時還發現AtNRT2s 其他成員AtNRT2.3和AtNAR2.1蛋白之間有微弱的互作。體外蛋白雜交的結果也表明HvNAR2.3和HvNRT2.1、AtNAR2.1與AtNRT2.1蛋白在根系細胞膜上存在互作［32，33］。Kotur等［34］進一步發現除了AtNRT2.7的其他AtNRT2s成員，即AtNRT2.1-AtNRT2.6蛋白都需要AtNAR2.1蛋白的協助才能定位于擬南芥原生質體膜上，在蟾卵和酵母雙雜交系統AtNRT2.1-2.6蛋白和AtNAR2.1蛋白的互作也得到驗證。已有的報道表明NAR2s蛋白都是小蛋白，僅有200多個氨基酸；AtNAR2.1和HvNAR2.1的蛋白結構中2個跨膜域形成一個大的環狀結構域，該環狀結構域是和NRT2作用的關鍵區域［30，32］。

1.3 植物硝酸鹽運輸蛋白的其他功能

研究表明硝酸鹽運輸蛋白基因存在著其他功能特性。在擬南芥中CHL1基因突變影響初生器官的發育，通過CHL1啟動子融合GFP和GUS蛋白發現CHL1基因在葉片保衛細胞中強烈表達；進一步研究發現該基因通過改變氣孔開放和蒸騰作用提高植物的抗干旱能力［35，36］。最近Li等［37］通過對atnrt1.8突變體的研究發現該基因具有調節植物對鎘毒害抗性的作用。硝酸鹽轉運蛋白可以調控植物的根系形態建成。最先報道的是擬南芥AtNRT1.1基因，它能感知外界NO3-和Glu信號從而影響植物根系形態建成；進一步的研究表明AtNRT1.1通過誘導ANR1基因的表達來影響側根的發生和發育［38］。除AtNRT1.1影響根系形態建成外，在低硝酸鹽的外界條件下AtNRT2.1在擬南芥根系形態建成中也發揮重要作用，其作用機制一方面是通過硝酸鹽吸收系統間接地影響根系形態；另一方面是在氮缺乏條件下直接影響側根的發生［39，40］。

2 植物硝酸鹽轉運蛋白的表達調控機制

植物硝酸鹽轉運蛋白的表達水平（mRNA和蛋白）調控決定著對硝酸鹽的吸收。硝酸鹽轉運蛋白表達受到很多因素的調控，如NO3-、NO2-、NH4+、 pH和光等，許多調控NO3-吸收的分子機制已經得到了證實（表1）。

2.1 硝酸鹽轉運蛋白的表達活性受NO3-調控

植物的高親和硝酸鹽轉運系統能夠迅速被外界的硝酸鹽誘導，但是數小時后吸收速率顯著下降，推測可能是由于NO-吸收后代謝產物或者內部NO-33的反饋抑制作用。在大麥、大豆、擬南芥以及水稻中，經氮素饑餓處理過的植株在恢復外界NO3-供應后，即使外界NO3-濃度只有10-50 μmol/L，植物體內NRT家族基因的mRNA豐度也會迅速升高［40］。在擬南芥中AtNRT2.1和AtNRT2.2兩個基因受NO-3誘導后在轉錄和蛋白水平的表達都迅速提高［41］，而其他一些氮素形態比如NH4+［36］、谷氨酰胺［42］都會對硝酸鹽轉運蛋白的表達產生一定的抑制效果。Yan等［26］也報道了在水稻中硝酸鹽轉運蛋白基因（OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a、OsNAR2.1）表達受NH4+和天冬氨酸的抑制。

AtNRT1.1是硝酸鹽的重要感受器，能感知外界硝酸鹽濃度并通過調節自身N端Thr101的磷酸化狀態而對硝酸鹽表現不同的親和特征，當外界硝酸鹽濃度較高時，AtNRT1.1的Thr101去磷酸化，表現低親和特性，此時AtNRT1.1抑制AtNRT2.1和AtNAR2.1的表達；當外界硝酸鹽濃度較低時，CIPK23催化AtNRT1.1的Thr101磷酸化，使其表現高親和特性［43］。

2.2 硝酸鹽轉運蛋白的表達活性受pH調控

Zhou等［44］研究表明pH能夠導致轉運蛋白對與之結合底物的改變，在pH6.0下BnNRT1.2蛋白可以大量運輸硝態氮，但在pH8.5條件下該蛋白又能大量運輸組氨酸。Tong等［30］發現HvNRT2.1和HvNAR2.3的雙組份高親和硝態氮運輸蛋白的活性隨著細胞質酸化而減弱，推測可能是因為細胞質內的酸性pH影響了HvNRT2.1和HvNAR2.3的二聚體的正確折疊進而導致蛋白活性下降。

2.3 硝酸鹽轉運蛋白的表達活性受晝夜節律調節

植物NO3-吸收在白天最高夜間最低。研究發現AtNRT1.1和AtNRT2.1基因的mRNA表達結果出現一致的趨勢，說明晝夜節律對NRT家族基因起調節作用。另外，在遮光下供應蔗糖也能讓基因轉錄水

平的表達大為提高［45］。說明NRT基因受晝夜節律調節關鍵的影響是光合作用的產物量，而6-磷酸-葡萄糖作為信號物質調控AtNRT1.1和AtNRT2.1基因的表達。

2.4 硝酸鹽轉運蛋白的表達活性受NAR2蛋白的協同調控

對于某些高親和硝酸鹽轉運蛋白需要其伴侶蛋白調控其活性，擬南芥（AtNRT2.1）、大麥（HvNRT2.3）以及水稻的（OsNRT2.1，OsNRT2.1，OsNRT2.3a）等轉運蛋白都需要在NAR2 蛋白存在條件下才具有硝酸鹽運輸活性，AtNRT2.1-AtNRT2.6蛋白都需要在AtNAR2.1 蛋白輔助下共定位到細胞質膜上。因此，NAR2很可能是高親和硝酸鹽轉運蛋白的調控因子。

2.5 硝酸鹽轉運蛋白的表達活性在蛋白水平上的調控

人們早期關于NRT2家族基因的研究表明NRT2基因的mRNA水平和硝酸鹽轉運蛋白活性相關性較大。最近，Laugier等［43］將35S-AtNRT2.1轉入突變體atnrt2.1得到基因回補植株，研究發現黑暗條件下野生型擬南芥中AtNRT2.1 的mRNA水平和硝酸鹽轉運蛋白活性下降，但是回補植株的AtNRT2.1的mRNA表達水平雖然沒有變化，其HATS活性也下降，蛋白檢測表明是因為基因在蛋白水平表達降低了［46］。這表明硝酸鹽轉運蛋白的表達活性在蛋白水平上的調控更為重要。

表1 植物硝酸鹽轉運蛋白基因受外界調控的研究進展

3 硝酸鹽響應的順式作用元件（NRE）和轉錄因子（TF）

植物中存在可能的響應硝酸鹽的順式作用元件NRE（Nitrate responsive cis-elements，NRE）。Rastogi等［57］在菠菜NiR基因啟動子序列中找到位于-200 bp/-230 bp的GATAN24bpGATA序列是響應硝酸鹽的關鍵元件，而且能和GATA類型的轉錄因子結合。另一個順式元件‘5-（A/T）7A（C/G）TCA-3’是發現于AtNIA1、AtNIA2基因，被認為是可能的NRE，但是也沒有在植物體內驗證該NRE的活性。Girin等［50］發現AtNRT2.1啟動子中一段150 bp的序列是NRE，并且在融合35S最小啟動子啟動的報告基因在轉基因擬南芥中有硝酸鹽響應的活性。

2010年，Konishi 等［58］報道AtNIR1基因啟動子序列一段-43 bp的序列5'-GACCCTTNAAG-3'為NRE，這段序列在融合35S最小啟動子和報告基因轉入擬南芥后報告基因GUS具有響應硝的活性。到目前為止還很難找到在所有不同硝酸鹽誘導的基因啟動子序列中都保守的NRE，這可能是因為對硝酸鹽響應的轉錄因子需要與多個NRE結合。目前在植物中還沒有明確被驗證的和這些NRE結合的硝響應的轉錄因子，僅在真菌和綠藻中發現屬于GATA類型的轉錄因子NirA和NIT4，能夠調節硝酸鹽響應基因的表達［59］。

4 結語

如何提高作物氮素利用率是目前生產中急需解決的問題。作物的高產和氮素利用率密不可分，隨著分子生物學技術的發展，人們越來越重視從分子水平上對作物的氮素利用效率進行遺傳改良。硝酸鹽轉運蛋白在作物吸收和轉運硝酸鹽過程中起關鍵作用。通過調控硝酸鹽轉運蛋白的表達可以提高作物的氮素利用率，為通過基因工程手段提高作物氮素利用效率提供了重要的理論依據。到目前為止，雖然已從不同植物中克隆出了多個硝酸鹽轉運蛋白基因，并通過過量表達植物硝酸鹽轉運蛋白基因研究了一些硝酸鹽轉運蛋白的功能，但是由于這些基因通常屬于一個多基因家族，單個硝酸鹽轉運蛋白基因所發揮的具體功能還不是特別清楚。例如，研究表明某些硝酸鹽轉運蛋白還具有負責其他元素的吸收及提高作物抗逆性的功能等。因此，仍然需要不斷深入的研究硝酸鹽轉運蛋白的基因功能。

硝酸鹽的吸收與利用是一個復雜的過程，除了硝酸鹽轉運蛋白外，還有許多硝酸鹽相關的轉錄因子及調控基因參加這個過程。目前有關硝酸鹽轉錄因子的研究還很少，與之相關的基因尚未被鑒定。隨著對硝酸鹽信號途徑的研究，發現相關硝酸鹽轉運蛋白基因、激素、轉錄因子基因通過復雜的代謝網絡調控植物的生長發育，但這復雜的基因調控網絡目前尚未解析。因此，采用轉錄組測序以及功能基因組研究技術研究硝酸鹽信號途徑將是今后研究工作的一個重點。

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（責任編輯 狄艷紅）

Function and Regulation Mechanisms of Nitrate Transporters in Higher Plants

Jia Hongfang Zhang Hongying Liu Weizhi Cui Hong Liu Guoshun
（College of Tobacco Science，Henan Agricultural University；National Tobacco Cultivation，Physiology and Biochemistry Research Center，Zhengzhou 450002）

Nitrate（NO3-）is main nitrogen sources which plants absorb from soil. There are two different uptake systems in plants to cope with low or high NO3-concentrations in soil, the high affinity systems（HATS）and low affinity NO3-uptake systems（LATS）. It is suggested that NRT1 and NRT2 families contribute to LATS and HATS for both NO3-uptake and distribution within the plant. Specific transport systems are essential for the uptake of NO3-and for its internal redistribution within plant. Over the past years, a significant advance has been obtained on the gene cloning, expression regulation and functional characterization of NRT1/2 transporters in higher plants. In this article, the research progresses on molecular level of known Nitrate transporters in higher plant in last decade were reviewed.

Higher plants Nitrate transporters Regulation mechanism Recent advances

2013-11-03

國家自然科學基金項目（31301837），中國煙草總公司特色優質煙葉開發重大專項濃香型項目（110201101001TS-01）

賈宏昉，男，博士，講師，研究方向：植物營養分子遺傳；E-mail：jiahongfang@126.com

劉國順，男，教授，博士生導師，研究方向：煙草生理生化；E-mail：liugsh1851@163.corn