利用城市糞便污水培養產油微藻的條件研究*

田 丹，桑力維，于 夕，Chung Wookjin，于景成

（1.北京昊業怡生科技有限公司，北京 100093；2.明知大學能源科學與技術系，韓國 449728）

糞便污水中COD、N、P濃度較高，糞便污水處理不同工藝階段中，微藻生長所需的N、P和其他營養元素的含量呈現不同的濃度水平，為微藻提供了更多選擇的培養基資源。因此，研究如何利用城市糞便污水培養產油微藻，實現糞便污水深度凈化和產油微藻低成本大規模培養，達到凈化水質的同時實現清潔能源生產的效果，對緩解能源短缺和環境污染問題具有重要的現實意義。筆者選擇已報道的幾種油脂含量較高的微藻，利用糞便污水馴化培養，從中篩選出能夠適應城市糞便污水環境的產油微藻。開展了利用不同處理階段的糞便污水培養產油微藻的條件研究，探討糞便污水處理和產油微藻生產工藝的耦合的可行性。確定了利用糞便污水培養產油微藻的最佳條件和微藻培養對糞便污水的凈化效果。為利用糞便污水大規模生產產油微藻，降低微藻生物柴油成本奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

1） 藻種：小球藻-1 （Chlorella vulgaris）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）購于中國科學院水生生物研究所藻種庫，小球藻-2（Chlorella vulgarisAG10032）、四尾柵藻 （Scenedesmus guadricauda）由韓國明知大學提供。

2） 培養基：蒸餾水配制的BG11培養基［1］，取自糞便處理站不同處理階段出水的污水培養基。其中UASB出水是指固液分離后的糞便污水經過升流式厭氧污泥床處理后的污水，MBR出水是UASB出水經過缺氧/好氧/膜生物反應器處理后的污水。糞便污水培養基經高壓滅菌后使用。

3） 設備：DT5-1型低速自動平衡離心機、LRH-250型生化培養箱、752型紫外可見分光光度計、XSZ-H顯微鏡、VS型潔凈實驗臺和RE-52CS型旋轉蒸發器等。

1.2 方法

1.2.1 微藻培養

實驗在溫度可調恒溫培養室中進行。采用錐形瓶作為藻種培養的反應器，錐形瓶用可透過空氣的無菌封口膜包扎。以三基色熒光燈作為光源，光強的控制通過開啟熒光燈的數量確定。微藻培養的初始吸光度0.1左右，每天搖動3次通入空氣補充CO2。

1.2.2 微藻藻種的馴化

用蒸餾水稀釋5倍的UASB出水與BG11標準培養基1∶1混合，作為藻種的初始馴化培養基，以BG11標準培養基作為對照。分別向250 mL錐形瓶中裝入100 mL培養基，再接入微藻。培養溫度25℃，光照強度3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h。實驗過程中每2 d取樣測定OD685nm，分析微藻細胞生長情況。

用UASB出水、MBR出水對初始馴化藻種進行二次馴化，以上述方法中的初始馴化培養基為對照，分別向1 L錐形瓶中接入600 mL培養基，再接入初始馴化后藻種。其余條件同上。

1.2.3 不同溫度的影響

分別使用UASB出水和MBR出水培養馴化后微藻，初始吸光度0.1左右。將微藻培養液分別放置于溫度為15、20、25、30、35℃，光照強度3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h條件下，測定微藻生長情況。

1.2.4 不同光照強度的影響

分別使用UASB出水和MBR出水培養馴化后微藻。將微藻培養液分別放置于光強為 1 500、3 000、4 500、6 000、8 000、10 000 lx，溫度為25℃，光暗周期12 h∶12 h條件下，測定微藻生長情況。

1.2.5 污水凈化效果

分別使用UASB出水和MBR出水在1.2.3和1.2.4中得到的最佳條件下培養馴化后微藻。為避免微藻進入衰亡期后，細胞破碎，營養物質溶出影響實驗結果，本實驗一次性培養6 d。將培養前后的藻液在4 000 r/min離心15 min，取上清液檢測水質指標。

1.2.6 油脂提取

將按照1.2.5方法培養離心后的藻種收集，使用石英砂研磨破碎，采用索氏提取法進行油脂提取和含量分析。

2 結果與討論

2.1 微藻藻種的馴化和選擇

有研究表明，為使自然界微藻適應高濃度污水環境，需以一定比例的污水與傳統標準培育基混合，對微藻進行初期的馴化培養［2］。通過對不同處理階段的糞便污水的成分和BG11標準培養基的成分進行對比分析發現，UASB出水稀釋5倍后，其總氮和總磷含量與BG11標準培養基相似。因此選擇用蒸餾水稀釋5倍的UASB出水按照1.2.2的方法對微藻進行初始馴化培養。由圖1可知，在最初5～8 d，幾種微藻的生長在糞便污水環境中有所抑制，處于適應期，小球藻-1在第6天，四尾柵藻在第8天開始快速增殖。而小球藻-2和布朗葡萄藻對糞便污水環境的適應能力較差。本研究選擇初始馴化后的小球藻-1和四尾柵藻進行后續實驗。小球藻-1和四尾柵藻在UASB出水、MBR出水中培養的結果顯示，糞便污水對小球藻-1和四尾柵藻的生長有明顯促進作用，在營養更為豐富的UASB出水中兩種微藻均能迅速積累生物量。同時，糞便污水也一定程度上延緩了微藻細胞衰亡，尤其是小球藻在BG11標準培養基中第4～6天生長減緩，進入衰亡期。而在糞便污水中第8天OD才開始緩慢降低。到培養的第12天時，小球藻-1在UASB出水培養液中的吸光度為標準培養基的2.89倍，表現出顯著差異。UASB出水、MBR出水均可以作為培養小球藻-1和四尾柵藻的優質培養基。

圖1 不同培養基中微藻的生長情況

2.2 不同溫度對污水中微藻生長情況的影響

有文獻指出，溫度是影響微藻生長和繁殖的重要環境因子之一，微藻的生長和產物的合成都是在各種酶催化下進行的［3］。溫度對微藻的生長和發育有調節作用，對酶的活性、營養物的吸收利用效率及細胞分裂的周期等諸多方面都存在不同程度的影響，溫度通過控制有關酶的活性來影響其生長，也可能是由于使細胞出現質壁分離而影響正常細胞的生命活力。在適宜溫度范圍內，溫度升高時細胞內的化學和酶促反應都以較快的速度進行，藻的生長也會越來越快，但是超過一定溫度后，細胞組分、蛋白質和核酸會受到不可逆的損害，這樣的損害是化學性的，這時細胞機能急劇下降到零。相反當溫度降低時，細胞新陳代謝的化學反應速率會減慢［4］。本研究對利用糞便污水培養的小球藻-1和四尾柵藻在不同溫度條件下的生長情況進行了觀察對比。

由圖2可知，在25℃下，小球藻-1和四尾柵藻的吸光度較高，生長速率較快，25℃是適宜UASB出水培養微藻的最佳溫度。不同溫度條件下MBR出水中培養微藻的生長情況與UASB出水的結果一致。

圖2 溫度對UASB出水中微藻生長情況的影響

實驗結果表明，除最適生長溫度25℃之外，小球藻和四尾柵藻在糞便污水中對溫度的耐受范圍比較廣。糞便污水產業化處理過程中UASB出水和MABR出水溫度在15℃以上，可直接用于微藻培養。

2.3 不同光強對污水中微藻生長情況的影響

本研究對不同光強下，小球藻-1和四尾柵藻在UASB污水和MBR污水培養基中的生長情況的對比觀察結果表明，糞便污水中的小球藻-1和四尾柵藻對光照強度的耐受范圍比較廣，在1 500～10 000 lx均可生長，1 500 lx時生長較緩慢。相對而言，污水中小球藻-1比較耐高光強。歐陽崢嶸等［5］研究表明，藻類對光照強度有1個飽和點，低于光飽和點，隨著光強的增加，藻類的光合速率加快；超過光飽和點，藻類的光合速率不再增加，甚至減弱、停止。還有研究發現［6］，在適宜的光強范圍內，光輻射能可以被微藻充分利用而以熱能形式耗散的量較少，光照強度增強會使微藻的光合電子傳遞速率和光合速率增高，促進微藻的生長和生物量積累。相反，當光強超過微藻的適宜光強范圍時，微藻對光能的熱耗散增加，并且熱耗散的強度隨光強的升高而升高［7］。因此，當光強較高時，光照強度的進一步升高并不一定會相應地使微藻的光合速率增高、生長加強，過量光能會以熱耗散的形式消耗掉而不能用于光合生產。

由圖3可知，在UASB出水和MBR出水培養基中，小球藻-1的光飽和點為8 000 lx，四尾柵藻的光飽和點為6 000 lx。在此光照強度下，兩種微藻的生長情況最好。

圖3 不同光強對UASB出水中微藻生長情況的影響

2.4 微藻對污水的凈化效果

國內外的研究表明，微藻對于市政污水、剩余污泥中的氮、磷等營養物質有凈化效果［1-2，8-9］。小球藻-1和四尾柵藻對UASB出水和MBR出水凈化效果的數據顯示，小球藻-1和四尾柵藻對UASB出水中總氮的去除率分別為9.88%和13.51%，總磷去除率分別為89.23%和72.45%，CODCr去除率分別為59.91%和69.31%。而對MBR出水，兩種微藻都表現為對氮磷的去除效果顯著，而對CODCr沒有去除效果，反而培養后CODCr略有增加。這是因為UASB出水中的CODCr為微生物易于利用的小分子有機物，而MBR出水中的CODCr多為微生物碎片，MBR出水培養微藻后，液體中存在少量微藻細胞碎片，造成MBR出水中CODCr升高。本實驗結果顯示，小球藻-1和四尾柵藻能利用糞便污水中的氮磷，有效凈化污水水質，降低糞便污水處理下游工序的處理負荷，見圖4。

圖4 微藻對糞便污水中污染指標的去除效果

2.5 糞便污水培養微藻的含油率測定

利用糞便污水培養的產油微藻的含油量的實驗結果顯示，兩種微藻在MBR出水培養條件下的油脂含量均高于普通條件，而UASB出水培養條件下油脂含量比普通培養條件下低。UASB出水培養的小球藻-1含油率為25.68%，MBR出水培養含油率為35.54%，BG11標準培養基培養為35.54%。四尾柵藻在UASB出水培養中含油率為22.61%，MBR出水中含油率為33.50%，BG11標準培養基培養條件下為30.90%。分析差異是由于產油微藻在逆境條件下積累脂類，在諸多影響微藻生物量和脂肪含量的因素中，氮元素影響最為明顯，在氮缺乏的條件下，微藻積累油脂。由此可見，如果考慮油脂產率，由糞便污水處理后的MBR出水培養的產油微藻含油率較高，可進行大規模培養。

3 結論

1）本研究表明產油微藻小球藻-1和四尾柵藻可利用經機械和生物處理后的城市糞便污水中的豐富營養成分，在溫度25℃，通過高效的光合作用，吸收糞便污水中的有效物質快速增殖生長。

2）微藻在糞便污水中生長時，對污水中的污染指標有去除效果，尤其是UASB出水中，氮磷及CODCr含量均顯著降低，可降低糞便污水處理下游工序的處理負荷。雖然利用UASB出水培養的產油微藻的油脂含量略低于普通培養條件，但是綜合考慮污水處理效果和產油微藻的培養成本，UASB出水是培養產油微藻的優異培養基選擇。

3）本研究得到利用城市糞便污水培養產油微藻的最佳條件，將糞便污水深度處理工藝與微藻生物柴油生產技術有機結合起來，以城市糞便污水作為資源進行微藻的規模化培養，既節約了水資源，降低微藻生物產油產業化發展中成本過高的問題，又轉移和深度凈化了城市糞便污水中的N和P等污染指標，有助于減輕水體富營養化，保護水體環境。本研究成果具有良好的發展前景和應用潛力。

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