上皮性鈣黏附蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-9在皮膚黑色素瘤及色素痣中的表達(dá)及意義

楊慧敏，黃一凡，謝賢鏞，李祖茂

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，四川 南充 637000)

黑色素瘤(melanoma)，又稱為惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)，是一種能夠產(chǎn)生黑色素的高度惡性腫瘤，多見于30歲以上人群，多發(fā)于皮膚即皮膚黑色素瘤(cutaneous melanoma，CM)，亦可見于黏膜及脈絡(luò)膜等處。CM具有高惡性度及高轉(zhuǎn)移率的特點(diǎn)，其發(fā)生與過度日曬、紫外線照射、皮膚色素痣等有關(guān)。臨床上非典型痣及病理上發(fā)育異常痣與黑色素瘤的高危險(xiǎn)性相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道[1]，有10個(gè)以上非典型痣的個(gè)體發(fā)生MM的相對(duì)危險(xiǎn)度為12(95%，CI 4.4～31)，并與全身痣的數(shù)量互為獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法觀察CM及色素痣中上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達(dá)情況，探討E-cadherin與MMP-9在CM發(fā)生發(fā)展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008年至2012年手術(shù)切除標(biāo)本68例，其中CM 48例，色素痣20例(皮內(nèi)痣及交界痣各10例)，均為福爾馬林固定后石蠟包埋標(biāo)本，所有病例HE染色后經(jīng)高年資病理診斷醫(yī)師復(fù)診確認(rèn)。CM患者中，年齡25～78歲，中位數(shù)55歲；男性27例，女性21例；病變位于足部18例，外陰9例，腿部8例，上肢和手部7例，軀干及頭面部6例；有明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例(復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況不限)；腫瘤厚度于光鏡下直接測(cè)量，浸潤(rùn)深度及分型參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]確定；所有病例術(shù)前未經(jīng)放化療。

1.1.2 主要試劑 即用型兔抗人E-cadherin單克隆抗體、即用型兔抗人MMP-9單克隆抗體、PV-9000免疫組化檢測(cè)試劑盒及濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法 采用EnVision二步法，按抗體及試劑盒說明書操作，具體如下：石蠟包埋組織塊切4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化組織切片；3% H2O2去離子水孵育10 min；E-cadherin檢測(cè)切片采用1 mM EDTA(pH8.0)高壓熱修復(fù)，MMP-9檢測(cè)切片采用0.01 M檸檬酸緩沖液(pH6.0)高壓熱修復(fù)；滴加一抗工作液，4 ℃過夜，后PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑1，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑2，37 ℃孵育20～30 min，PBS沖洗，2 min×3次；應(yīng)用DAB工作液顯色5 min左右，自來水充分沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。用PBS替代一抗做陰性對(duì)照，用已知陽性的結(jié)腸癌/肝臟組織切片做為E-cadherin/ MMP-9檢測(cè)的陽性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定 E-cadherin陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)著色，MMP-9陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)著色，表示為陽性部位呈均勻顆粒狀或線性棕黃色。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡(400×)視野，對(duì)比背景著色觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度及計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。E-cadherin陽性結(jié)果參考江文靜等[3]的方法，即先按染色強(qiáng)度計(jì)分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：顯示明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色。陰性為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)計(jì)分相加所得總分進(jìn)行結(jié)果判定：0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，>4分為強(qiáng)陽性(++)，即3分及以上則判定為陽性。MMP-9陽性結(jié)果參考王連等[4]的方法：先按染色強(qiáng)度計(jì)分：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。再按陽性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。陽性強(qiáng)度為兩種記分之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～5分為中等強(qiáng)度陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)，即1分及以上則判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin及MMP-9表達(dá)情況

CM組織中E-cadherin及MMP-9陽性表達(dá)率分別為37.5%(18/48)及79.2%(38/48)；色素痣組織中E-cadherin及MMP-9的陽性表達(dá)率分別為85%(17/20)及10%(2/20)[其中交界痣組織中陽性表達(dá)率分別為80%(8/10)及20%(2/10)，皮內(nèi)痣組織中陽性表達(dá)率分別為90%(9/10)及0%(0/10)]。E-cadherin及MMP-9在CM與色素痣中表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為12.752及27.884，P均<0.01)。在兩種色素痣中E-cadherin及MMP-9的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均>0.05。

2.2 E-cadherin及MMP-9表達(dá)與CM病例臨床病理特征的關(guān)系

E-cadherin和MMP-9的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤厚度及分型無關(guān)(P>0.05)(表1)。

2.3 E-cadherin及MMP-9在CM中表達(dá)的相關(guān)性

E-cadherin及MMP-9在CM中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.45，P<0.01)，見表2。

表1 E-cadherin及MMP-9在CM中表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

表2 E-cadherin及MMP-9在CM中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程的重要步驟包括細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在其中擔(dān)任了重要的角色。MMPs是一類肽鏈內(nèi)切酶，目前發(fā)現(xiàn)的有20多種，可降解組織基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的多種蛋白質(zhì)成分[5]。MMP-9是分子量為92 kDa的明膠酶B，主要由巨噬細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞合成分泌，可降解Ⅳ、Ⅴ型膠原等。基底膜的主要成分為Ⅳ型膠原，因此MMP-9在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中起著十分重要的作用，其表達(dá)增加與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加呈正相關(guān)，這一結(jié)論已在對(duì)多種惡性腫瘤的研究中得到證實(shí)[6-7]。

鈣黏附蛋白(cadherin)是一類與Ca2+依賴性細(xì)胞間黏附相關(guān)的糖蛋白，包括E-、P-、N-cadherin等。E-cadherin是一種穿膜蛋白，在大多數(shù)上皮組織中表達(dá)，在上皮細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要作用，其下調(diào)與多種上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有一定的相關(guān)性[8]。

雖然這兩種蛋白在惡性腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用已在研究中被證實(shí)，但其在CM及色素痣中的表達(dá)情況卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)48例CM及20例色素痣組織中E-cadherin及MMP-9的表達(dá)，結(jié)果顯示，與色素痣組織相比，MMP-9在CM中表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與張娟等[9]的研究結(jié)果相一致，提示MMP-9可能在CM的發(fā)生發(fā)展特別是色素痣惡性演變中起重要作用。紀(jì)長(zhǎng)偉等[10]發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤荷瘤小鼠腫瘤病灶中E-cadherin的表達(dá)隨發(fā)病時(shí)間推移下調(diào)，而本研究結(jié)果提示E-cadherin在CM中表達(dá)較色素痣中有明顯降低，提示E-cadherin的表達(dá)缺失可能與CM浸潤(rùn)進(jìn)展有關(guān)。

有關(guān)E-cadherin和MMP-9在腫瘤中特別是在CM中表達(dá)的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道很少，Akdeniz等[11]研究發(fā)現(xiàn)，隨喉鱗癌分化程度降低，MMP-9的表達(dá)增高，而E-cadherin表達(dá)則降低，且E-cadherin表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度有關(guān)。在E-cadherin和MMP-9與CM患者臨床病理特征的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)：E-cadherin和MMP-9在CM中的表達(dá)變化與腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與其余臨床病理特征如年齡、性別等關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。浸潤(rùn)深度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響CM預(yù)后的重要因素，提示E-cadherin表達(dá)下調(diào)及MMP-9表達(dá)增高或可作為判斷CM預(yù)后不良的指標(biāo)。對(duì)E-cadherin和MMP-9在CM中的相關(guān)性分析顯示二者表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，提示MMP-9表達(dá)上調(diào)伴隨有E-cadherin表達(dá)下調(diào)，可能與E-cadherin下調(diào)致使腫瘤細(xì)胞間黏附松散，便于脫離原發(fā)灶往間質(zhì)浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者之間是否存在拮抗作用及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)研究我們認(rèn)為MMP-9及E-cadherin表達(dá)與黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。MMP-9上調(diào)可能與E-cadherin下調(diào)共同促進(jìn)了黑色素瘤的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床病理檢測(cè)CM組織中E-cadherin及MMP-9的表達(dá)可能對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)及淋巴道轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高低起到預(yù)測(cè)作用。

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