結(jié)腸癌中caspase9表達(dá)程度與癌周炎癥程度關(guān)系的研究

木爾扯爾，文 彬，黃一凡，劉 鈞

(1.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000)

以往的研究顯示，線粒體凋亡途徑的核心因子caspase9在結(jié)直腸癌中表達(dá)下降[1-4]；但本課題組先前的研究中，用IHC和RT-PCR法研究了大樣本人體結(jié)腸癌中caspase9蛋白和mRNA的表達(dá)，卻發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中caspase9蛋白、mRNA的表達(dá)與正常結(jié)腸相比表達(dá)并無降低，反而有升高的趨勢(另文發(fā)表，尚未見刊)。經(jīng)過仔細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)部分切片的癌周組織中有程度不等的炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。會不會是結(jié)腸癌周圍炎細(xì)胞的浸潤引起caspase9表達(dá)異常升高，從而拮抗腫瘤發(fā)生時抑制caspase9表達(dá)的作用？查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)以下研究與我們的問題相關(guān)：如于慶生等[5]發(fā)現(xiàn)，大鼠腸黏膜受到缺血-再灌注損傷后，發(fā)生炎癥的腸黏膜中caspase9等凋亡因子的mRNA顯著增多，而用藥物控制缺血-再灌注引起的腸黏膜炎癥后，caspase9等凋亡因子mRNA又顯著減少；王衛(wèi)等[6]亦發(fā)現(xiàn)在高糖刺激下，腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞株中炎癥介質(zhì)NLRP3(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族NLRs的成員)的表達(dá)明顯增高，且凋亡相關(guān)因子caspase-3蛋白的表達(dá)也隨之增高，細(xì)胞凋亡率升高；而用SiRNA轉(zhuǎn)染方法抑制NLRP3表達(dá)后，細(xì)胞凋亡受到明顯抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)，NLRs另一個成員NALP1不僅可與caspase5結(jié)合形成炎癥復(fù)合體，激活caspase1和caspase5及其下游的炎癥因子如IL-1β，IL-18和IL-33的前體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展，也可與細(xì)胞線粒體凋亡途徑的Apaf-1，caspase9相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[7]。以上這些文獻(xiàn)雖然都不是研究腫瘤凋亡與炎癥之間關(guān)系的直接文獻(xiàn)，但證明組織發(fā)生炎癥后，可引起caspase9表達(dá)升高和細(xì)胞凋亡增多。基于這些提示，我們研究了caspase9表達(dá)程度與腫瘤周圍炎細(xì)胞浸潤程度的關(guān)系，以期分析先前我們實驗結(jié)果與其他研究不符的原因，并初步探討腫瘤形成后，炎癥對腫瘤凋亡的影響作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科確診存檔的2004年至2006年原發(fā)性結(jié)腸癌蠟塊138例。其中男性89例，女性49例；最小16歲，最大84歲，平均(56.0±13.7)歲，中位年齡57歲。其中管狀腺癌109例(78.9%)，黏液腺癌23例(16.7%)，管狀腺癌合并黏液腺癌的3例(2.2%)，乳頭狀腺癌2例(1.4%)，未分化癌1例(0.7%)，未見其他如腺鱗癌、小細(xì)胞癌及類癌等組織學(xué)類型病例。以上實驗標(biāo)本均未做過術(shù)前放化療，患者均知情同意，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。

1.2 免疫組化染色

caspase9兔抗人多克隆濃縮抗體購自福建邁新公司。caspase9蛋白的表達(dá)采用EnVision兩步法檢測，抗體濃度1∶200。結(jié)果判定：caspase9棕黃色或棕黑色顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分可定位于細(xì)胞核。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比對組織切片進(jìn)行測定劃分：0分，無上皮性細(xì)胞著色；1分，<25%的上皮性細(xì)胞陽性；2分，25%～50%的上皮性細(xì)胞陽性；3分，50%～75%的上皮性細(xì)胞陽性，4分，>75%的上皮性細(xì)胞陽性。著色強度則用以下方法測定：0分，無陽性細(xì)胞 ；1分，輕微著色；2分，中度著色；3分，高度著色。將兩分?jǐn)?shù)相加，得分在0～7之間。切片觀察由2個高年資病理醫(yī)師單獨進(jìn)行打分，最后取平均分，0～2分為陰性，3分及以上為陽性(3分為﹢，4～5分為﹢﹢，6～7分為﹢﹢﹢)。

1.3 癌周炎癥程度的確定

結(jié)腸癌癌周的炎癥程度確定參照非癌組織的炎癥程度判斷方法：從炎細(xì)胞分布密度，炎細(xì)胞組織浸潤面積和組織浸潤深度三方面綜合評估，該工作也由兩個高年資的病理醫(yī)師進(jìn)行，結(jié)果分為無、輕度、中度和重度炎細(xì)胞浸潤四個等級。結(jié)果不一致的重新討論后確定，最后將結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果綜合進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPASS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，等級資料相關(guān)分析用spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

138例結(jié)腸癌中caspase9蛋白表達(dá)與癌周炎癥程度的相關(guān)性分析：以癌周炎癥程度將138例結(jié)腸癌分成四組： A組為重度炎細(xì)胞浸潤組(27例)；B組為中度炎細(xì)胞浸潤組(28例)；C組為輕度炎細(xì)胞浸潤組(43例)；D組為無炎細(xì)胞浸潤組(40例)。對癌周炎癥程度與癌中caspase9蛋白表達(dá)進(jìn)行spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示(表1)。癌周炎癥程度等級與結(jié)腸癌中caspase9的陽性程度表達(dá)呈正相關(guān)，spearman秩相關(guān)系數(shù)rs=0.364，P=0.000。

表1 癌周炎癥程度與癌中caspase9蛋白表達(dá)的spearman相關(guān)分析

*R×C 秩相關(guān)分析，P<0.01。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生與經(jīng)典wnt通路的異常有極其密切的關(guān)系：當(dāng)wnt通路發(fā)生異常時，β-catenin可出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)異常表達(dá)[8]，進(jìn)而可轉(zhuǎn)位入核，激活下游增殖相關(guān)調(diào)控信號和抑制下游凋亡相關(guān)通路的激活，使細(xì)胞發(fā)生過度增殖，最后導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。以caspase9為核心的線粒體凋亡途徑正是照wnt通路下游的一個凋亡通路[9]。因此按wnt通路與線粒體凋亡途徑理論上的關(guān)系，當(dāng)結(jié)腸癌發(fā)生后，癌中caspase9表達(dá)理應(yīng)下降，凋亡減少； caspase9蛋白在不同結(jié)腸組織的表達(dá)也應(yīng)滿足如下的關(guān)系：正常結(jié)腸>結(jié)腸腺瘤>結(jié)腸癌。然而我們先前的實驗結(jié)果卻出現(xiàn)了與上述理論相反的結(jié)果：caspase9蛋白、mRNA在結(jié)腸癌中caspase9表達(dá)均高于其在正常結(jié)腸組織中表達(dá)。

為進(jìn)一步分析實驗結(jié)果與理論相悖的原因，我們分析了138例結(jié)腸癌中caspase9表達(dá)程度與癌周炎癥程度的關(guān)系。結(jié)果顯示，癌周炎癥程度與結(jié)腸癌中caspase9的陽性程度表達(dá)呈spearman正相關(guān)關(guān)系，且有統(tǒng)計學(xué)意義；caspase9在炎癥程度等級為A、B組結(jié)腸癌中的陽性表達(dá)(圖1)顯著高于癌周浸潤程度為C、D組結(jié)腸癌組中表達(dá)(圖2)。這些結(jié)果提示，結(jié)腸癌中caspase9蛋白的表達(dá)程度隨炎癥程度的加劇而升高；但若caspase9在結(jié)腸癌中表達(dá)上升，會進(jìn)一步激活以caspase9為核心的細(xì)胞線粒體凋亡途徑，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡；因此從這個角度來講，顯然癌周炎癥對癌患者是有益的，因為其起了抗癌的作用。在臨床上也可以見到這樣的現(xiàn)象，即癌患者腫瘤組織中炎癥越重(非腫瘤中心及壞死引起的炎癥)，其手術(shù)預(yù)后反而較好，可能就與炎癥參與抗腫瘤作用有關(guān)。然而根據(jù)傳統(tǒng)的觀點，炎癥卻是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，特別是慢性炎癥與結(jié)直腸癌的發(fā)生有極為密切的關(guān)系：在持續(xù)炎癥的刺激下，正常結(jié)腸逐漸發(fā)生瘤變產(chǎn)生結(jié)腸腺瘤，最后在結(jié)腸腺瘤的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展為結(jié)腸癌[10]，因此病理學(xué)上把結(jié)直腸的慢性炎癥歸為是癌前病變。雖然目前研究炎癥與腫瘤發(fā)生之間關(guān)系的文獻(xiàn)主要以炎癥如何引起腫瘤發(fā)生為主[11]，而對腫瘤生成后，炎癥對腫瘤影響作用的研究甚少；但根據(jù)本實驗結(jié)果結(jié)合傳統(tǒng)的觀點[10-11]，結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)的提示[5-7，12]，筆者推測炎癥在腫瘤的不同階段，可能扮演了不同的角色，早期炎癥對腫瘤的發(fā)生起促進(jìn)作用，晚期對腫瘤起抗腫瘤免疫的角色，從而使機體抗腫瘤免疫作用增強，激活了細(xì)胞凋亡途徑，而caspase9為核心的細(xì)胞線粒體凋亡途徑就是被激活的其中之一。

但以上觀點畢竟只是實驗基礎(chǔ)上的一種推測，要充分證明結(jié)腸癌形成后炎癥對結(jié)腸癌起抗腫瘤免疫的作用，還需要更深入的實驗來證明，這也是我們下一步的實驗?zāi)繕?biāo)。

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