尖銳濕疣皮損中人β防御素(HDB)－2,3及LL－37的表達

王 薇 肖敬川 王泉江

·短篇論著·

尖銳濕疣皮損中人β防御素(HDB)－2,3及LL－37的表達

王 薇 肖敬川 王泉江

目的: 檢測尖銳濕疣患者皮損中抗菌肽HBD－2、HBD－3及LL－37mRNA的表達。方法:應用逆轉錄(RT－PCR)方法檢測56例尖銳濕疣患者皮損和30名正常人皮膚組織中HBD－2、HBD－3及LL－37mRNA的表達。結果: 與正常人皮膚組織相比,尖銳濕疣患者皮損中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的表達水平明顯升高(P＜0．05)。結論: 尖銳濕疣患者皮損中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA表達水平的上調可能與尖銳濕疣患者局部產生免疫防御有關。

尖銳濕疣； 人乳頭瘤病毒； HBD－2； HBD－3； LL－37

尖銳濕疣(condyloma acuminata,CA)是一種由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染的性傳播疾病(STD)。本病極易復發,有報道我國復發率達到38%。人β防御素及LL－37是一類可誘導表達的抗菌肽(antimicrobial peptide),在機體的局部直接和間接發揮其免疫防御作用。本實驗采用RT－PCR方法檢測CA皮損中人β防御素(HDB)－2,3及LL－37的表達,探討其表達的臨床意義及其在CA中的防御機制。

1 病例與方法

1．1 病例 2010年1月至2012年12月本院皮膚科門診經HPV－DNA檢測及臨床確診的56例CA患者,其中男34例,女22例。年齡16～74歲,平均28±13．1歲,所有患者均為初發,未接受任何治療。正常對照組30名,年齡17～65歲,平均31±4．3歲,皮膚標本均為排除包皮龜頭炎癥的包皮組織。

1．2 標本采集 56例CA患者,均為初發皮損。其中23例為包皮部位皮損,11例為腹股溝區皮損,12例為小陰唇內側皮損,8例為大陰唇部皮損,2例為肛周皮損。

1．3 方法

1．3．1 總RNA的提取 取皮損標本50 mg加1mL Trizol(美國MBI公司),總RNA提取嚴格按照試劑盒說明書進行操作。提取出的RNA用紫外分光光度計(美國bio－rad公司)測定其純度及濃度后,溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)配制的TE水中,－70℃保存以備用。

1．3．2 cDNA的合成 按逆轉錄試劑盒說明書(美國MBI公司)操作,取備用總RNA 1μL,加Oligo(dT) 181μL,再加去RNA酶的去離子水至總體積為12 μL,混勻后離心3～5 s,70℃孵育5 min后置于冰上,然后按順序加入5×RT緩沖液4μL,RNA酶抑制劑1 μL。dNTP(10 mmol/L)2μL,37℃孵育5 min后再加入逆轉錄酶1μL,使終體積達到20μL。42℃反應1 h,70℃10 min終止反應,置于冰上。得到的cDNA－20℃保存或直接行PCR擴增。

1．3．3 PCR擴增 PCR反應總體積為20μL,其中10 ×PCR緩沖液2μL,MgCl2(25 mmol/L)2μL,dNTPs (10 mmol/L)2μL,10 mmol/L上游及下游引物各1 μL,TaqDNA聚合酶1 U,cDNA模板2μL,最后加去離子DEPC水補充到總體積為20μL。擴增條件為: 95℃預變性2 min后按94℃變性20 s,57℃退火40 s, 72℃延伸40 s,共循環31次。HBD－2上游引物:5'－CCAGCCATCAGCCATGAGGGT－3',下游引物:5'－GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA－3',擴增產物片段大小為254 bp。HBD－3上游引物:5'－AGCCTAGCAGCTATGAGGATC－3',下游引物:5'－CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA－3',擴增產物片段大小為206 bp。LL－37上游引物:5'－GAAGACCCAAAGGAATGGCC－3',下游引物:5'－TCAGAGCCCAGAAGCCTGAG－3'。擴增產物片段大小為547 bp。設β－肌動蛋白做內參照物,擴增產物片段大小為150 bp。上述引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應產物于1%瓊脂糖凝膠穩壓電泳。GOLDVIEWI染色選用DNA Marker I(天根生物公司)作為分子質量標準,以5 V/cm電泳20min,紫外燈下觀察結果并攝影。

1．3．4 圖像分析 用β－肌動蛋白做內參照,對HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA進行半定量,采用圖像分析系統掃描儀(美國bio－rad公司)測定每組標本LL－37、HBD－2,以及β－肌動蛋白擴增產物的電泳條帶的灰度值,分別計算出HBD－2、HBD－3及LL－37與β－肌動蛋白的相對比值(即LL－37/β－肌動蛋白,HBD－2/β－肌動蛋白),以此代表HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的相對水平。

1．4 統計學方法 采用SPSS 11．5統計軟件分析,所得計量資料采用方差齊性檢驗后的t檢驗或校正t'檢驗。

2 結果

2．1 總RNA純度及濃度的測定結果 提取的RNA其A260/A280值為1．8～2．0,表明總RNA純度較好,無污染。

2．2 PCR產物鑒定 HBD－2 mRNA擴增片段為254 bp,HBD－3 mRNA擴增片段為206 bp,LL－37 mRNA擴增片段為547 bp,β－肌動蛋白mRNA擴增片段為150 bp,與理論設計相符(圖1～3)。

圖1 HBD－2的RT－PCR產物電泳圖圖2 HBD－3的RT－PCR產物電泳圖圖3 LL－37的RT－PCR產物電泳圖

2．3 RT－PCR產物圖像分析 CA患者皮損及正常人皮膚組織中均有HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的表達,CA患者皮損中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA的表達水平較正常人皮膚組織明顯增高,差異均有統計學意義(P＜0．05),見表1。

表1 CA患者皮損與正常人皮膚中HBD－2、HBD－3及LL－37 mRNA表達水平比較

3 討論

目前觀點認為宿主免疫缺陷可以使易感個體受到HPV的感染。由于乳頭瘤病毒在終末分化的表皮細胞內完成復制循環,并通過表皮釋放子代病毒,使病毒抗原易于逃逸免疫監視系統,因此,HPV感染比其他的微生物感染更難去除。但是大量免疫正常的宿主感染HPV后最終可以痊愈,這說明許多被感染的宿主可以通過增加有效的免疫應答來抵御HPV感染。

天然表皮、黏膜免疫的重要成分是抗菌肽,目前發現存在于人體皮膚的抗菌肽主要屬于兩個家族:防御素(defensins)家族和cathelicidin家族。它們具有廣譜的抗細菌、抗病毒、抗真菌及抗腫瘤等生物活性。人類防御素可分為α防御素、β防御素(HBD)。HBD－2,3由包括角質形成細胞在內的上皮細胞所產生。LL－37是在人體內發現惟一的cathelicidin家族抗菌肽,主要表達于某些骨髓源性細胞(中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等)、角質形成細胞、組織上皮細胞及某些腺體易與微生物發生接觸的部位。有觀點認為抗菌肽通過斷裂病毒脂質體或影響細胞的信號轉導來干擾病毒復制及病毒受體的黏附。1HBD－2由化學因子受體CCR6介導,可在低濃度下趨化記憶T細胞及未成熟樹突細胞來參與天然及獲得性免疫。2LL－37可破壞病毒的包膜、限制病毒產物的毒性作用及募集炎癥細胞以清除病原微生物來發揮殺傷效應,也可通過激活G蛋白偶聯受體FPRLs(甲酰基肽受體)對外周血中的中性粒細胞、單核細胞、T細胞具有化學趨化作用,其在表皮抵御微生物進一步侵襲具有重要的保護作用。3－6

本研究結果提示,CA患者皮損局部的抗菌肽HBD－2、HBD－3及LL－37表達上調(P＜0．05),其與皮損部位產生免疫防御有關,人體可通過抗菌肽(HBD－2、HBD－3及LL－37)發揮其天然免疫作用抵御病毒入侵,天然免疫機制又可觸發機體產生獲得性免疫,但其具體機制尚待進一步研究。

1Selsted ME,Ouellette AJ．Mammalian defensins in the antimicrobial immune response．Nat Immunol,2005,6:551－557．

2Yang D,Chertov O,Bykovskaia SN,et al．β－defensins:linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6．Science,1999,286:525－528．

3 Conner K,Nern K,Rudisill J,et al．The antim icrobial peptide LL－37 is expressed by keratinocytes in condyloma acuminatum and verruca vulgaris．JAm Acad Dermatol,2002,47:347－350．

4 De Yang,Chen Q,Sehmidt AP,et al．LL－37,the neutrophil granule－and epithelial cell－derived cathelicidin．utilizes formyl peptide receptor－like 1(FPRLl)as a receptor to ehemoattraet human peripheral blood neutrophils,monocytes,and T cells．J Exp Med,2000,192(7):1069－1074．

5 Scott MG,Davidson DJ,Gold MR,et a1．The human antimicrobial peptide LL－37 is a multifunetionalmodulator of innate immune responses．J Immunol,2002,169(7):3883－3891．

6蔡林,孫青苗．抗菌肽與皮膚疾病關系的研究進展．中國皮膚性病學雜志,2011,1(25):1－5．

(收稿:2013－04－19)

The expression of human beta defensins(HBD)－2,3 and LL－37 in the patients w ith condyloma acum inatum

WANGWei,XIAO Jing-chuan,WANG Quan-jiang.Haikou People's Hospital,Hainan,570208

Objective:To investigate themRNA expression of antimicrobial peptide HBD－2,HBD－3 and LL－37 in the patientswith condyloma acuminatum(CA)．Methods:The skin biopsieswere taken from skin lesions in 56 patientswith CA and 30 normal controls．Reverse transcriptase－polymerase chain reaction(RTPCR)was used to semi－quantitatively analyze themRNA expression of HBD－2,HBD－3 and LL－37 in the tissue samples．Results:ThemRNA expressions of HBD－2,HBD－3 and LL－37 were significant higher in CA than in the normal controls(P＜0．05)．Conclusion:Up－regulated expression of HBD－2,HBD－3 and LL－37 may be related to local immune defense of CA．

condyloma acuminatum；human papilloma virus；human beta defensin－2；human beta defensin－3；antimicrobial peptide LL－37

海南省海口市人民醫院,570208