血小板添加液體外保存血小板質量的研究

劉立坤，李永乾

(河北醫科大學第三醫院輸血科，河北 石家莊 050051)

血小板的標準保存方法是20～24℃恒溫振蕩保存，此條件下血小板制品易受污染，保存期僅為5d[1]，難以滿足臨床大量需求。應用添加液低溫保存血小板已引起廣泛關注，研制適用于低溫冷藏血小板的保存液非常有意義。我們采用含海藻糖的添加液替代65%血漿10℃冷藏單采血小板保存7d，并對血小板有關指標進行了檢測，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器：血小板添加液成分，海藻糖75.00g/L、Na2HPO43.05g/L、KCl 0.37g/L、NaH2PO4·2H2O 1.05g/L、NaCl 4.05g/L、MgCl2·6H2O 0.30 g/L、Na3枸櫞酸·2H2O 3.18g/L[2]；血細胞計數儀(日本Sysmex公司)；血小板聚集分析儀(美國Chronolog公司)；血氣分析儀(法國Nova公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；CL-8000型全自動生化分析儀(日本島津)。

1.2 血小板的制備及保存：取20份單采血小板，將其分為2組，實驗組離心(1 000g，10min)，保留35%血漿，加入65%的血小板添加液混勻，10℃冷藏靜置保存，對照組用100%血漿維持在(22±2)℃常溫保存，于1、5、7d分別取樣測定2組pH、血小板計數(plateled count,PLT)、低滲休克反應(hxpotonic shock response,HSR)、血小板形變能力(extent of shape change,ESC)、血小板P選擇素(cluster of differentiation 62 platelet,CD62p)、葡萄糖(glucose,GLU)平均消耗量和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)平均釋放量等指標。

1.3 血小板制品質量評價指標的檢測：用血細胞計數儀測定PLT；用血氣分析儀測定pH；采用血小板聚集分析儀法測定ESC和HSR[3]；以IgG1PE為陰性對照，CD62pPE標記后，用流式細胞儀檢測CD62p表達率[4]；采用酶顯色法測定LDH，采用葡萄糖氧化酶法測定GLU。

2 結 果

2.1 2組體外保存血小板質量的比較：隨著時間延長，2組pH值均呈逐漸下降趨勢，但實驗組pH較高，2組組間、不同時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.01)；2組PLT指標比較平穩，在組間、不同時點間以及組間·時點間交互作用差異均無統計學意義(P>0.05)；HSR、ESC隨著時間延長逐漸下降，CD62p隨著時間延長逐漸升高，但2組間HSR、ESC和CD62p只在不同時點間差異有統計學意義(P<0.01)，組間和組間· 時點間交互作用差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別pH1d5d7dPLT(×1011/L)1d5d7dHSR(%)1d5d7d實驗組7.30±0.037.22±0.057.10±0.0712.6±1.512.1±1.312.5±1.373.5±8.065.2±8.361.7±5.2對照組7.26±0.047.04±0.076.80±0.0912.4±1.412.1±1.412.4±1.273.0±8.066.3±8.363.0±5.6組間F=196.811 P=0.000F=0.027 P=0.871F=0.306 P=0.584時點間F=345.368 P=0.000F=1.545 P=0.220F=56.718 P=0.000組間·時點間F=53.769 P=0.000F=0.016 P=0.984F=0.486 P=0.617組別ESC(%)1d5d7dCD62p(%)1d5d7d實驗組16.5±3.87.6±1.35.4±0.628.9±10.139.9±10.944.3±11.0對照組16.8±4.07.4±1.15.3±0.829.1±10.240.6±11.245.6±11.6組間F=0.008 P=0.931F=0.084 P=0.774時點間F=330.135 P=0.000F=109.546 P=0.000組間·時點間F=0.150 P=0.861F=0.021 P=0.979

PLT：platelet；HSR：hxpotonic shock response；ESC：extent of shape change；CD26p：cluster of differentiation 62 platelet

2.2 2組GLU消耗量和LDH釋放量比較：1～7d試驗組GLU平均消耗量及LDH平均釋放量均明顯低于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組保存期間GLU消耗量和LDH釋放量比較

組別GLU平均消耗量LDH平均釋放量實驗組0.08±0.030.15±0.03對照組0.12±0.020.25±0.04t4.9618.944P0.0000.000

GLU：glucose；LDH：lactic dehydrogenase

3 討 論

血小板對溫度變化極為敏感，4℃保存的血小板輸注體內后會很快被清除，止血功能遠低于20～24℃保存的血小板[5]。當溫度低于20℃血小板就會從正常的鐵餅狀變成圓球狀，并發生聚集而被激活。目前標準的血小板保存條件是在20～24℃振蕩保存，存放有效期僅為5d。如何增加血小板存活率及延長其保存期，減少血小板活化，已成為目前研究的熱點。應用添加液保存血小板不僅可以減少輸血反應的發生率，還可以節約大量的血漿資源，血小板添加液能很好地維持血小板的功能。海藻糖分子比較小，能夠填充到生物蛋白質大分子的空隙中，使生物蛋白質大分子的內部結構變化受到限制，能抑制寒冷導致的血小板變形聚集[6]；海藻糖性質穩定、不易降解，在體內的分解產物是兩分子的葡萄糖，對機體無毒副作用，是一種非常有研究潛力的低溫血小板保護劑[7]。本研究是在血小板保存添加液Ⅲ的基礎上添加海藻糖配制成血小板添加液，并以血小板添加液替代65%自體血漿保存單采血小板。

血小板的止血功能主要取決于血小板形態、活化水平、代謝情況等，反映血小板膜是否完整的重要指標主要有血小板HSR[8]；血小板形態常用ESC來評價[9]；pH與血小板的損傷相關密切；CD62p是存在于血小板α顆粒膜上的蛋白質分子，血小板激活后CD62p能與血小板質膜融合表達于血小板膜的表面，是血小板活化的較重要標志[9]，CD62p的變化與血小板活化程度具有相關性[4]。在本研究中，2組pH值在組間、不同時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.01)，表明血小板在保存期間實驗組的保存環境優于對照組；隨著保存時間的延長，2組HSR、ESC逐漸下降，CD62p表達率明顯升高，2組間HSR、ESC、CD62p只在不同時點間差異有統計學意義(P<0.01)，組間和組間· 時點間交互作用差異均無統計學意義(P>0.05)，表明添加海藻糖的血小板添加液在較低溫度(10℃)時對血小板起到了很好的保護作用；2組PLT指標比較平穩，在組間、不同時點間以及組間·時點間交互作用差異均無統計學意義(P>0.05)，進一步證明了以上觀點。10℃條件細胞代謝功能較20℃降低，血小板的GLU消耗量明顯低于常溫，LDH主要存在于細胞內部，當細胞受到損傷破壞后才會釋放出來，本研究顯示LDH在實驗組的釋放量低于對照組，證明血小板添加液保存的血小板完整性較血漿對照組好。以上結果均提示血小板保存在以血小板添加液替代65%自體血漿的混合液中與100%血漿中的效果相當。

總之，在10℃液態狀態下，使用血小板添加液部分替代血漿保存單采血小板可使血小板的功能得到良好的保護，既延長了血小板的保存期限，又降低了血小板制品受污染的概率。雖然現階段使用血小板添加液保存單采血小板的相關資料還比較少，但本研究數據提示，采用血小板添加液10℃低溫保存單采血小板效果與傳統的常溫血漿保存方法相當，本研究將為血小板保存技術的發展提供一定的依據。

[1] 趙燕,趙海濤,韓威,等.M-sol血小板保存液對血小板體外保存期間質量的影響[J].中國輸血雜志,2011,24(3):233-234.

[2] 王昕,史蓉華,李靜,等.改良血小板添加液低溫液態保存血小板的形態及功能研究[J].中國實驗血液學雜志,2009，17(3):797-801.

[3] 黃成垠,肖建宇,蔣妮真,等.2種血小板低滲休克反應測定方法的比較研究[J].中國輸血雜志,2008,21(7):514-516.

[4] WAGNER SJ,SKRIPCHENKO A,MYRUP A,et al.Calcium is a key constituent for maintaining the in vitro properties of platelets suspended in the bicarbonate containing additive solution M-sol with low plasma levels[J].Transfusion,2010,50(5):1028-1035.

[5] 王慶敏,肖建宇,蔣昵真,等.血小板添加液保存單采血小板的研究[J].臨床輸血與檢驗，2012,14(1):34-37.

[6] 劉軍,王琳,高志剛,等.血小板產品保存介質的研究進展[J].吉林醫學,2011,32(35):7573-7574.

[7] 胡彬,趙林,閻慧芝,等.海藻糖對保存血小板分泌可溶性CD40L抑制作用的研究[J].中國輸血雜志,2010,23(6):439-440.

[8] 曹惠,卓海龍,徐麗娟,等.單采血小板保存期間部分參數的改變及其意義[J].中國醫藥導報,2012,9(13):86-87.

[9] THON JN,SCHUBERT P,DEVINE DV Platelet storage lesion: a new understanding from a proteomic perspective[J].Transfus Med Rev,2008,22(4):268-279.