人參須根中皂苷類成分的指紋圖譜研究

姚紅娥，張梅，徐秒，陳璐，謝學(xué)軍

·炮制制劑·

人參須根中皂苷類成分的指紋圖譜研究

姚紅娥1，張梅1，徐秒1，陳璐1，謝學(xué)軍2

目的：采用高效液相色譜法研究不同產(chǎn)地人參須根中皂苷類成分的指紋圖譜。方法：PhenomenexC18（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相：A為乙腈，B為水，梯度洗脫，柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。結(jié)果：人參須根中皂苷類成分指紋圖譜檢出13個(gè)共有峰，但各批藥材相同成分的含量差異較大，其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好。結(jié)論：該方法可為人參須根的質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)為課題后期研究奠定基礎(chǔ)。

]人參須根；人參皂苷；高效液相色譜法；指紋圖譜

人參為常用中藥，其藥理作用廣泛，影響人體多種系統(tǒng)器官，與阿膠、鹿茸并稱為中藥三寶。人參皂苷為人參的主要活性成分之一，具有抗感染、抗疲勞、抗腫瘤、舒張血管等多重活性。人參在臨床上主要用其主根和根莖入藥，但亦有研究表明，人參須根（人參的干燥細(xì)支根或須根）中皂苷的組成成分與人參主根基本一致[1]，且其皂苷含量比主根高[2,3]。本課題組前期研究亦表明含人參須根的補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變有較好的治療作用[4,5]。為進(jìn)一步研究該復(fù)方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探討組方藥物人參須根在其中的藥效活性，筆者對(duì)人參須根的指紋圖譜進(jìn)行了研究，以期為后續(xù)研究提供依據(jù)。

近年來(lái)，有許多學(xué)者對(duì)人參中人參皂苷指紋圖譜進(jìn)行了研究，賈曉斌等[6]采用高效液相色譜法建立了人參皂苷類成分的指紋圖譜，標(biāo)示出了人參藥材16個(gè)共有峰。Wu等[7]采用DR-NIR和ATR-FTIR對(duì)人參表皮、木質(zhì)部、韌皮部進(jìn)行紅外圖譜鑒別，所得數(shù)據(jù)表明紅外光譜法可用于人參不同部位的鑒別。但是關(guān)于人參須根中皂苷類成分指紋圖譜的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本課題擬以不同來(lái)源的人參須根為研究對(duì)象，建立其皂苷類成分的化學(xué)指紋圖譜，了解其成分組成，旨在為人參須根的臨床用藥和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；Agilent 1200 DAD檢測(cè)器；Phenomenex C18（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱。

1.2 試劑

乙腈為色譜純，水為超純水，其余均為分析純。

1.3 藥材

人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：must-12102301，純度≥98%），購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；人參須根，購(gòu)自東北三省，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定為五加科植物人參Panaxginseng C.A. Mayer的干燥細(xì)支根或須根。藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 人參須根樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex C18（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相：A為乙腈，B為水，梯度洗脫，柱溫：35℃，流速1.0mL．min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備

[8,9]并結(jié)合前期研究結(jié)果制備供試品：稱取人參須根粗粉5.0 g，50%乙醇超聲提取2次，每次100 mL，提取時(shí)間為40 min，合并2次提取液并減壓抽濾，濾液常壓蒸干。加入15 mL水充分溶解，加入15 mL乙醚脫脂兩次，取水層加水飽和正丁醇萃取，收集正丁醇液，常壓蒸去溶劑即得人參皂苷提取物。取人參皂苷提取物，加乙腈：水（5:95）配制成每1 mL含0.02 g的溶液，過(guò)0.45 μm 的微孔濾膜，即得。

2. 3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加乙腈：水（5:95）配制成每1 mL含Rb1為0.2 mg的對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在同一色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在同一色譜條件下，分別于0h、2h、8h、12h、24h 進(jìn)樣，各共有峰相對(duì)峰面積RSD小于1.5%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次人參須根樣品，按“2.2”項(xiàng)下的制備方法，分別制備5份供試品溶液，在同一色譜條件下分別進(jìn)樣，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

取10批人參須根樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，進(jìn)行HPLC指紋圖譜測(cè)定，得到相應(yīng)的色譜指紋圖譜，見(jiàn)圖1。在不同批次的樣品色譜圖中共發(fā)現(xiàn)13個(gè)共有峰，因人參皂苷Rb1峰面積較大且穩(wěn)定，選定為參照峰。以人參皂苷Rb1色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，見(jiàn)表3、表4。

圖1 10批藥材人參皂苷提取物指紋圖譜

表3 指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

7 1.088 1.089 1.086 1.090 1.085 1.089 1.086 1.084 1.088 1.088 1.087 0.195 8 1.184 1.180 1.189 1.189 1.188 1.187 1.183 1.180 1.182 1.186 1.185 0.349 9 1.218 1.216 1.219 1.214 1.221 1.214 1.217 1.212 1.222 1.219 1.217 0.322 10 1.387 1.382 1.390 1.386 1.389 1.389 1.387 1.382 1.382 1.391 1.387 0.344 11 1.419 1.418 1.418 1.415 1.442 1.420 1.418 1.415 1.415 1.418 1.420 0.799 12 1.823 1.828 1.823 1.826 1.819 1.826 1.823 1.818 1.818 1.821 1.823 0.350 13 2.021 2.023 2.018 2.019 2.018 2.021 2.025 2.025 2.022 2.023 2.022 0.259

表4 指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

2.6 指紋圖譜相似度計(jì)算

(2)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)防火墻技術(shù)。該種技術(shù)是有效控制網(wǎng)絡(luò)訪問(wèn)安全性的一種計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)安全防護(hù)技術(shù)，其可以確保計(jì)算機(jī)內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)環(huán)境運(yùn)行的安全性與穩(wěn)定性。防火墻技術(shù)主要是基于網(wǎng)絡(luò)交互性，通過(guò)借助既定程序來(lái)檢查網(wǎng)絡(luò)傳輸數(shù)據(jù)，看其是否滿足網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的傳輸要求或標(biāo)準(zhǔn)，借此來(lái)阻止或允許網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的通行。

將10批人參須根的高效液相色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)2004A版”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立人參皂苷提取物的共有模式，生成人參須根中人參皂苷的對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖2。采用上述軟件進(jìn)行相似度分評(píng)價(jià)，所得10批樣品的相似度分析結(jié)果見(jiàn)表5。

圖2 10批樣品皂苷提取物對(duì)照?qǐng)D譜

表5 10批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)在相同的色譜條件下，考察了Phenomenex C18（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱，Agilent Hypersil ODS(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱和島津C18（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱的分離效果，三根色譜柱的譜圖除保留時(shí)間有差別外，色譜峰的分離及峰型也有一定的差別。其中Phenomenex色譜柱的分離度較好，峰型尖銳，因此選用該色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

3.2 梯度洗脫條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)中色譜分離過(guò)程采用梯度洗脫，考察了多組流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)，(1)乙腈（A）：水（B）(0 min～15 min 21 %A，15 min～25 min 21%～24%A，25 min～60 min 24%～40%A)；(2) 乙腈（A）：0.1 %磷酸溶液（B）(0 min～15 min 21%A，15 min～25 min 21%～19%A，25 min～30 min 19%～22%A，30 min～50 min 22%～31%A，50 min～60 min 31%A，60 min～80 min 31%～40%A)；(3)乙腈（A）：0.1 %磷酸溶液（B） (0 min～10 min 5%～10%A，10 min～19 min 10%～25%A，19 min～35 min 25%A，35 min～40 min 25%～32%A ，40 min～65 min 32%A，65 min～75 min 32%～50%A，75 min～110 min 50%～95%A)；(4) 乙腈（A）：水（B）(0～10 min5%～10 %A，10～19 min 10%～25%A，19 min～32 min 25%A ，32 min～37 min 25%～32%A，37 min～63 min 32%A，63 min～73 min 32%～45%A，73 min～75 min45%～50%A，75 min～110 min 50 %～95 %A，110 min～120 min95%A)。結(jié)果顯示，以流動(dòng)相系統(tǒng)(4)分離度好，故選擇該洗脫條件。

3.3 柱溫的選擇

本研究在相同的色譜條件下，考察了柱溫對(duì)色譜分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)中考察了25℃、30℃、35℃等不同柱溫的分離情況，結(jié)果表明在35℃時(shí)分離效果較好，色譜峰之間距離適中。

3.4 參照物的選擇

3.5 指紋圖譜分析

通過(guò)對(duì)10批不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，10批藥材相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1%，但相對(duì)峰面積RSD值較大，表明各藥材相同成分含量相差較大。10批藥材相似度分析發(fā)現(xiàn)S8、S9樣品的相似度偏低，說(shuō)明產(chǎn)地的不同會(huì)影響人參須根中皂苷的種類和含量。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的人參須根中人參皂苷的HPLC指紋圖譜的各成分分離較好，基本達(dá)到了基線分離，且方法簡(jiǎn)單易行，可作為人參須根皂苷類成分鑒別的依據(jù)，為后期研究提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 常建濤,富瑤瑤,吳迪,等. 敦化人參各部位皂苷組分的比較[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011, 30(1):43.

[2] 孫芳,吳迪,付紹平,等.移山參、園參各部位中皂苷組成和比例的研究[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,26(2):97.

[3] 劉春瑩,宋建國(guó),李鵬飛,等.3種人參中的皂苷的組成[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011, 30(2):80.

[4] 馬殿偉,謝學(xué)軍,李曉微,等.TGF-β2干預(yù)的缺氧狀態(tài)下補(bǔ)腎活血?jiǎng)?duì)Müller細(xì)胞及谷氨酰胺合成酶活性的影響[J].眼科研究,2010,28(5):408.

[5] 馬榮,謝學(xué)軍,萬(wàn)李,等.補(bǔ)腎活血中藥血清對(duì)高糖狀態(tài)下純化培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29(10):892．

[6] 賈曉斌,黃一平,施亞芳,等.人參皂苷類成分的指紋圖譜研究[J].中藥材,2001,24(10):722.

[7] Wu Y H,Li Q Q, Zheng Y, et al. Study on difference between, epidermis, phloem and xylem of Radix Ginseng with nearinfrared and infrared spectroscopy coupled with principal component analysis [J].Vib spectrosc,2011,55:201.

[8] 孫聰,曾鵬濤,李天一,等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選人參總皂苷提取工藝的研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(3):533.

[9] 鄭義,陸輝.人參總皂苷提取工藝的優(yōu)化研究[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào),2008,24(2):89.

（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Studies on the HPLC fngerprints of ginsenoside in ginseng fbrous root

/YAO Hong-e1, ZHANG Mei1, Xu Miao1, CHENLu1, XIE Xue-jun2//(1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China; 2. School of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China)

Objective: To study the HPLC fngerprints of ginsenoside in ginseng fbrous root from different area. Method: The separation was performed on Phenomenex C18（250mm ×4.6mm,5μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile and water with gradient elution. The column temperature was 35℃, and the wavelength of detector was 203 nm. Result: 13 peaks were observed on the HPLC fngerprint of ginsenoside, but the contents were quite different. The precision, stability and repeatability were good. Conclusion: The method can provide a reference for quality control of ginseng fbrous root and lay the foundation for futhuer research.

Ginseng fbrous root; ginsenoside; HPLC; fngerprints

R 284

A

1674-926X(2014)02-011-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072845）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075

姚紅娥，碩士研究生 Email: yaohonge@sina.cn

張梅，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究工作

Tel:028-61800231 Email: zhangmei63@126.com；謝學(xué)軍，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治眼底病的基礎(chǔ)與臨床研究工作

Tel:028-87783541 Email: xxj8848@163.com

2013-12-13