LC-MS測定火腿腸中4種硝基呋喃類代謝物殘留

白亞敏，毛慶，秦劍，肖陳，沈銳

（1.重慶市食品藥品檢驗所，重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶401121；2.黔江縣藥品檢驗所，重慶409000；3.永川市藥品檢驗所，重慶402160）

LC-MS測定火腿腸中4種硝基呋喃類代謝物殘留

白亞敏1，毛慶1，秦劍1，肖陳2，沈銳3

（1.重慶市食品藥品檢驗所，重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶401121；2.黔江縣藥品檢驗所，重慶409000；3.永川市藥品檢驗所，重慶402160）

建立同時測定火腿腸中4種硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的液相色譜-質譜方法。火腿腸樣品均質后，用0.2mol/L鹽酸水解，經鄰硝基苯甲醛衍生后過固相萃取小柱凈化，收集洗脫液用氮氣吹干定容后，采用多反應監測模式進行檢測，同位素內標法定量。添加濃度為0.498 ng/mL～5.070ng/mL時，4種硝基呋喃類藥物代謝物的回收率為76.7%～109.6%，相對標準偏差為3.0%～8.9%。該方法靈敏度高，檢出限低，準確性好，可用于火腿腸中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的測定。

硝基呋喃類；液相色譜-質譜法；固相萃取；火腿腸；同位素內標

硝基呋喃是一類人工合成的廣譜抗菌藥，最常見的包括呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮，其對應的代謝物分別是：5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-內酰脲（AHD）和3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）。硝基呋喃類藥物具有非常好的抗菌作用，曾廣泛用于畜禽和水產品的養殖過程。已有研究表明，硝基呋喃類藥物對人體具有潛在的致癌性，可能導致基因變異且具有遺傳毒性[1-2]。歐盟和美國分別在1995年和2002年全面禁止將硝基呋喃類藥物用于食源性動物。2008年我國也將全部硝基呋喃類藥物列入違法添加的非食用物質名單。火腿腸的主要原料為畜禽肉和魚肉，其產品標準中并未將硝基呋喃類獸藥殘留列入必檢項目，所以少量不法商家將硝基呋喃類獸藥殘留量不合格的畜禽肉和魚肉用作火腿腸的生產，使人民群眾的健康安全受到威脅。目前檢測火腿腸中硝基呋喃類代謝物殘留量的文獻尚未見報道，因此，建立此方法對于保障人民群眾的食品安全具有重要意義。硝基呋喃類藥物在動物體內代謝迅速，所以待測組織中通常不太可能檢出硝基呋喃原藥殘留，但其代謝產物因和蛋白質結合而相當穩定，故利用對代謝產物的檢測通常可以反映出硝基呋喃類藥物的殘留狀況[3-4]。本文擬采用液相色譜-質譜法檢測火腿腸中硝基呋喃類代謝物殘留量。鄰硝基苯甲醛作為衍生化試劑與在酸性條件下水解游離出來硝基呋喃類代謝物的自由氨基反應，從而可以增大待測物的分子量，提高質譜檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈（色譜純）：Burdick＆Jackson公司；甲酸（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；乙酸銨（分析純）：重慶川東化工有限公司；乙酸乙酯（分析純）：重慶川東化工有限公司；正己烷（分析純）：成都科龍化工試劑廠；AMOZ（含量99.8%）：Sigma公司；SEM（含量99.5%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；AHD（含量99.0%）：Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；AOZ（含量98%）：Toronto公司；同位素內標物D5-AMOZ：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；13C15N-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ：均為WITEGA公司；鄰硝基苯甲醛（含量＞99%）：TGI公司；OASISHLB固相萃取柱：美國Waters公司。

液相色譜-質譜儀UPLC-TQD：美國Waters公司；漩渦混合器：海門市其林貝爾公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-C型）：金壇市華峰儀器公司；臺式高速離心機：TD16-WS型長沙湘儀公司。

1.2 色譜條件和質譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm× 50mm，1.7μm），流動相A相為乙腈（含0.1%甲酸），B相為10mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脫程序為：10%A 0min～0.5min；10%～50%A 0.5min～1.5 min；50%A 1.5min～2.4min；50%～90%A 2.4min～2.5min；90%A 2.5min～4.4min；90%～10%A 4.4min～4.5min；10%A 4.5min～6min，流速0.3mL/min，柱溫40℃，進樣體積5μL，毛細管電壓3.5 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流速12 L/min，錐孔氣流速0.2 L/min，碰撞氣為氬氣，離子源ESI+，MRM模式檢測見表1。

1.3 樣品的處理

稱取2.0 g均質后的火腿腸樣品置離心管，用甲醇-水混合溶液（1∶1）洗滌（10mL×2）后，加入50 ng/mL混合內標溶液0.2 mL、0.2 mol/L鹽酸溶液20 mL及0.1mol/L鄰硝基苯甲醛衍生化試劑0.3mL，渦旋振蕩1min，置37℃恒溫振蕩水浴中避光反應16 h。上述衍生溶液放置至室溫后，加入0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液5mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH為7.4～7.8，6 000 r/min離心10min。上清液用正己烷脫脂（5mL× 2）后以2mL/min的流速通過OasisHLB固相萃取柱（已分別用10mL甲醇和10mL水活化），用10mL水洗滌抽干，最后用10mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液40氮氣吹至近干，以甲醇-水溶液（1∶1）定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜。

表1 衍生后的4種硝基呋喃代謝物和相應內標物的質譜參數Table1 MS parameters of four nitrofuran metabolites

1.4 標準曲線的制備

分別取適量20ng/mL的混合標準溶液加入50ng/mL的混合內標溶液0.2mL，按上述1.3樣品的處理方法衍生凈化后用甲醇-水溶液（1∶1）定容為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的混合標準使用溶液，其中4種內標物的濃度均為10 ng/mL。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

4種硝基呋喃類藥物代謝物的極性和結構非常類似，因此液相色譜中采用梯度洗脫的方式來改善4種物質的分離度。此外，待測物都是弱堿性化合物，適用于正離子監測模式，故在流動相中添加了乙酸銨和甲酸作為離子化助劑，以提高離子化效率，增強質譜的靈敏度。

2.2 樣品前處理條件的選擇

火腿腸的輔助原料包括淀粉、食鹽、香辛料、防腐劑以及護色劑等。其中的食鹽和亞硝酸鈉等強電解質會抑制樣品中的待測物質離子化，降低質譜的靈敏度，因此先將樣品用甲醇-水的混合溶液洗滌兩次以除去其中水溶性的強電解質。此外，火腿腸中的脂肪也會影響待測物質離子化過程，且容易堵塞固相萃取小柱，因此用正己烷脫脂兩次。固相萃取小柱可以凈化火腿腸樣品并減少雜質干擾。

2.3 靈敏度的差異

呋喃妥因的代謝物經衍生后質譜的靈敏度與其他3種化合物的靈敏度差別較大，僅從分子結構上分析，4種化合物均含有2～3個氨基，離子化程度及靈敏度應該相似，而且對照品溶液的濃度和處理過程相同，故推斷是其衍生化效率不同而導致質譜靈敏度的差異。

2.4 線性范圍、回歸方程和檢出限

在最佳分析條件下，以4種硝基呋喃代謝物的衍生物的定量離子對的峰面積與對應內標峰面積之比對濃度作圖，即得標準曲線方程，取標準曲線的最低濃度分別稀釋2、5、10倍進樣，按S/N=3∶1計算檢出限見表2。

表2 線性范圍、回歸方程和檢測限Table2 Linear analysis and limited of detection of four nitrofuran metabolites

2.5 回收率

均質后的火腿腸樣品，添加不同濃度的混合標準溶液對樣品處理后進行回收率和精密度實驗，測定4種硝基呋喃代謝物的衍生物的回收率為76.7%～109.6%，RSD為3.0%～8.9%見表3。

2.6 樣品測定

抽取市場上4個品牌14批火腿腸樣品進行檢測，其中5批檢出1～2種硝基呋喃類藥物代謝物，含量為0.072μg/kg～3.856μg/kg，其余9批未檢出上述4種硝基呋喃類藥物代謝物。

3 結論

本文建立了以LC-MS方法檢測火腿腸中的硝基呋喃代謝物的殘留量的最佳檢測條件。由于采用硝基呋喃類代謝物的同位素內標法進行定量分析，提高了檢測的穩定性和定性定量分析的準確性；固相萃取法提取火腿腸中的硝基呋喃代謝物回收率高、重現性好，完全可以滿足實際檢測需要。

表3 方法回收率及精密度（n=6）Table3 Recovery of four nitrofuran metabolites

[1]吳永寧,邵兵,沈建忠．獸藥殘留檢測與監控技術[M]．北京:化學工業出版社,2007:461-474

[2]Leitner A,Zollner P,Lindner W．Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]．Chromatogr A,2001, 939:49-53

[3]孫濤,胡開峰,喬昆云,等．超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中硝基呋喃代謝物殘留[J]．分析儀器,2010(5):27-31

[4]徐英江,任傳博,田秀慧,等．海產品中硝基呋喃類原藥的超高效液相色譜串聯質譜測定[J]．分析測試學報,2010,29(4):327-330

Determination of Metabolites of Nitrofuran Antibiotics in Sausage by LC-MS

BAI Ya-min1，MAO Qing1，QIN Jian1，XIAO Chen2，SHEN Rui3
（1.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；2.Qianjiang Institute for Drug Control，Chongqing409000，China；3.Yongchuan Institute for Drug Control，Chongqing402160，China）

A method was established to determine metabolites of nitrofuran antibiotics in sausage.Homogenized samples were hydrolyzed with 0.2 mol/L hydrochloric acid，and then derivatized by 2-nitrobenzaldehyde. Analytes were cleaned by solid phase extraction（SPE）and reconstituted after dried under nitrogen.LC-MS detection was performed using multiple reaction monitoring module.The quantification was obtained utilizing the homologous internal standards.Recoveries of metabolites of nitrofuran antibiotics were from 76.7%to 109.6%at fortified levels of 0.498 ng/mL-5.070 ng/mL.The RSDs of the method were3.0%-8.9%.The established method is sensitive，accurate and suitable for the determination of nitrofuran metabolites in sausage.

Nitrofuran；liquid chromatography/mass spectrometry（LC-MS）；solid phase extraction；sausage；homologous internal standard

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.026

2013-01-05

重慶市科技攻關計劃項目(cstc2012ggB10001)

白亞敏（1977—），女（漢），工程師，研究生，主要從事食品藥品檢驗與研究工作。